Aspectos generales de la tecnología del ADN recombinante.

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MEXICO[pic 1][pic 2]

COLEGIO DE CIENCIAS Y HUMANIDADES

PLANTEL SUR

Perales Alcantara Luis Enrique

Grupo: 405 A

“Aspectos generales de la tecnología del ADN recombinante.”

Prof. Shizuru Ledesma Jorge

29 de Enero del 2016

Tecnología del ADN recombinante.

Lo notable acerca de los cambios dirigidos por los humanos es que han logrado hacerlos más rápido. Los investigadores analizan los genes con la tecnología del ADN recombinante. Recortan y combinan el ADN de diferentes especies y lo insertan en celulas bacterianas, de levaduras o de mamíferos. Las celulas replican su ADN y se dividen con rapidez; copian el ADN extraño como si fuera propio y producen cantidades útiles de moléculas de ADN recombinante. Esta tecnología también constituye el fundamento de la ingeniería genética. Mediante este proceso, los genes se aíslan, modifican e insertan en el mismo organismo o en otro distinto. Los productos proteicos de los genes modificados pueden cubrir las funciones de sus contrapartes faltantes o que funcionan mal. Esta nueva tecnología da lugar a problemas sociales, legales, ecológicos y éticos con respecto a sus beneficios y riesgos.

El ADN recombinante contiene el ADN de dos o más fuentes diferentes, como una célula humana y una célula bacteriana. Para obtener el ADNr, un técnico necesita un vector, mediante el cual el ADNr se podrá introducir en la célula anfitriona. Un vector común es un plásmido. Los plásmidos son pequeños anillos accesorios de ADN que se encuentran en las bacterias. El anillo no es parte del cromosoma bacteriano y se replica por su propia cuenta. Algunos investigadores que estudiaban a la bacteria escherichia coli descubrieron los plásmidos. Para introducir el ADN extraño a un ADN vector son necesarias dos enzimas: 1) Una enzima de restricción, la cual segmenta el ADN, y 2) una enzima llamada ADN ligasa, la cual sella el ADN en la abertura creada por la enzima de restricción. Cientos de enzimas de restricción se presentan de manera natural en las bacterias, donde destrozan cualquier ADN viral que ingrese a la célula. Reciben el nombre de enzimas de restricción debido a que restringen el crecimiento de los virus, pero también actúan como tijeras moleculares para segmentar cualquier pieza de ADN en un sitio específico. Por ejemplo, la enzima de restricción llamada EcoRI siempre recorta la doble cadena del ADN cuando su secuencia de bases presenta la siguiente forma:[pic 3]

Observe que hay un espacio en el cual puede colocarse una porción de ADN extraño si termina en bases que complementen a las expuestas por las enzimas de restricción. Para lograrlo, solo es necesario segmentar el ADN extraño con el mismo tipo de enzima de restricción.

 Los extremos complementarios y de una sola cadena de las dos moléculas de ADN se denominan “extremos adherentes” debido a que pueden unir una pieza de ADN extraño mediante un apareo de bases complementario. Los extremos adherentes facilitan la inserción del ADN extraño en un ADN vector.

Después, los ingenieros genéticos utilizan la ADN ligasa para sellar el fragmento extraño del ADN en el vector. El empalme del ADN queda entonces completo; se ha obtenido una molécula de ADNr. Las celulas bacteriales recogen los plásmidos recombinantes, en especial si están tratados para hacerlos más permeables. Luego, a medida que el plásmido se replica, el ADN se clona.

Para que un gen humano se exprese en una bacteria, debe estar acompañado por regiones reguladoras exclusivas de las bacterias. Además un gen no debe contener intrones debido a que las bacterias no los tienen. No obstante, es posible producir un gen humano que carezca de intrones. La enzima llamada transcriptasa inversa puede usarse para obtener una copia de ADN a partir de moléculas del ARNm. La molécula de ADN, llamada ADN complementario (ADNc) no contiene intrones. Por otra parte, es posible obtener pequeñas piezas de ADN en el laboratorio. Una maquina llamada sintetizador de ADN reúne la secuencia correcta de nucleótidos y el ADN resultante carece también de intrones.

Enzimas de restricción

En los años 50, la comunidad científica se quedó atónita ante el descubrimiento de la estructura del ADN. Sin embargo, la emoción dio paso a la frustración, pues nadie podía determinar la secuencia de nucleótidos: el orden de los genes y las regiones genéticas a lo largo de un cromosoma. Robert Holley y sus colaboradores determinaron la secuencia de u pequeño ARNt. Utilizaron enzimas digestivas para romper la molécula en fragmentos tan pequeños como para caracterizarlos químicamente. Pero ¿qué ocurría con las moléculas de ADN? Estas son mucho más largas que las de ARN. Nadie sabía cómo corar una de ellas en fragmentos suficientemente largos como para contener secuencias únicas, y por lo tanto analizables. Las enzimas digestivas cortan el ADN pero sin seguir un ordenados esos fragmentos en la molécula.

Entonces, por accidente, Hamilton Smith descubrió que la bacteria Haemophilus influenzae corta el ADN extraño que se le inserta mediante un bacteriófago. Los extractos que se le inserta mediante un bacteriófago Los extraños de celulas H. influenza incluyen una enzima que se restringe a un sitio especifico en el ADN. Se le dio el nombre de enzima de restricción. Con el transcurso del tiempo, varios cientos de cepas de bacterias permitieron obtener un conjunto de enzimas de restricción que reconocen y cortan secuencias específicas de cuatro a ocho bases en el ADN. En la tabla 16.1 se da una lista de algunas de ellas. Son tan solo algunas de las diversas enzimas que realizan cortes escalonados, que dejan “colas” de cadenas únicas del extremo de un fragmento de ADN. Las colas que se obtienen con TaqI  tienen una longitud (AATT).

¿Cuántos cortes efectúan las enzimas de restricción? Eso depende en parte de la molécula. La Notl solo reconoce una secuencia poco común de ocho bases en el ADN de los mamíferos, de modo que cuando efectúa sus cortes, la mayoría de los fragmentos miden decenas de miles de pares de bases de largo. Eso permite estudiar el genoma: todo el ADN que constituye el numero haploide de cromosomas de una especie. En la especie humana, el genoma mide aproximadamente 3.2 miles de millones de pares de bases de largo.

Enzimas de modificación

Los fragmentos de ADN con cortes escalonados presentan extremos pegajosos. La palabra “pegajoso” significa que la cola de cadena única del fragmento de restricción puede formar un apareamiento de bases con una cola complementaria de cualquier otro fragmento de ADN o molécula cortada por la misma enzima de restricción Al mezclar fragmentos de ADN cortados por la misma enzima de restricción, los extremos pegajosos de dos fragmentos con secuencias de bases complementarias se aparearan. Formando una molécula de ADN recombinante.

Vectores de clonación para amplificar el ADN.

Las enzimas de restricción y modificación hacen posible insertar ADN extraño a celulas bacterianas. Como sabes, las celuas bacterianas solo tienen un cromosoma: una molécula de ADN circular. Muchas también heredan plásmidos. Un plásmido es un círculo muy pequeño de ADN adicional que mide tan solo algunos genes y se replica junto con el cromosoma bacteriano. Generalmente las bacterias pueden sobrevivir sin plásmidos, pero algunos de los genes les aportan beneficios, por ejemplo les confieren resistencia a los antibióticos. En condiciones favorables las bacterias se dividen con rapidez y a menudo: en algunas especies cada 30 minutos, de modo que es posible formar poblaciones enormes de celulas genéticamente idénticas. Antes de la división celular, las enzimas de replicación duplican el cromosoma bacteriano. En ocasiones también replican al plasmido de manera repetida, de modo que una célula puede presentar muchas copias idénticas del ADN extraño. En los laboratorios de investigación, el ADN extraño típicamente se inserta a un plásmido para que lo replique. El resultado se denomina clon de ADN, porque las celulas bacterianas preparan copias idénticas o “clonadas” del mismo.

Un plásmido modificado que acepta ADN extraño constituye un vector de clonación. Puede insertar el ADN extraño a una bacteria huésped, a una levadura o a alguna otra célula que sea el inicio de una “fábrica” de clonación” al dar lugar a una población de celulas descendientes que se dividen con rapidez, y todas ellas contienen copias idénticas del ADN extraño.

Bacteriofagos lambda y cosmidos como vectores.

Los plasmidos son útiles como vectores porque se multiplican rápidamente dentro de las bacterias y son fáciles de manipular algunos se multiplican con más rapidez que otros y, en consecuencia, tienen una ventaja evolutiva. Como se esperaría cuanto mas grande sea el plasmido más tiempo necesitara para replicarse. Asi, aunque los plasmidos toleran sus secuencias cortas de ADN extraño, a lo largo de las generaciones, tienden a eliminar los segmentos más largos por esta razón, los plasmidos son vectores confiables solo para segmentos de ADN de hasta 10.000 pares de bases de longitud. Para clonar segmentos de ADN más grande, de hasta 20.000 pares de bases de longitud, pueden utilizarse como vectores bacteriófagos lambda especialmente modificador. Ciertas capas de lambda tienen sitios de reconocimientos para enzimas de restricción que permiten eliminar las zonas centrales del ADN.

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