Fermentaciones

una fermentación es llevada a cabo por microorganismos anaeróbicos facultativos

METODOS PARA LA DETERMINACION DE LA BIOMASA

Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales (Rodríguez et al, 2005).

En esta perspectiva, en la presente práctica se verá algunos aspectos que deben ser considerados para la determinación de biomasa utilizando un método directo el recuento microscópico.

Por lo tanto el desarrollo de la práctica tiene como objetivo emplear el recuento microscópico para determinar el número de levaduras por mililitro de una muestra de 50 ml al 0.1 % de levadura.

La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso. Ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico.

Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. Los métodos de enumeración celular son métodos de observación, basados en propiedades físicas o en la actividad biológica. Actualmente hay un gran interés en métodos alternativos de determinación de Ia biomasa. Estos métodos son indirectos y estiman algún componente celular o alguna actividad metabólica específica. No requieren el examen visual de los organismos ni su incubación (Arnáiz et al, 2000).

2.2. Métodos directos de determinación de la biomosa

2.2.1. Métodos gravimétricos

La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración.

La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no solo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles.

Los métodos gravimétricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles (Arnáiz et al, 2000).

2.2.2. Métodos espectrofotométricos

Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal parámetro a partir de una sola medida de la turbidez.

Se trata de métodos rápidos, pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partículas (Arnáiz et al, 2000).

2.2.3. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras

Existen diversos tipos de cámaras para el recuento de microorganismos tales como la cámara de Neubauer. Thoma, Bürker, Türk, Fuchs-Rosenthal, Malassez, Petroff Hauser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células. ml-1, generalmente).

El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las irregularidades en la distribución de la muestra. Además. Pueden confundirse las células con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células vivas de células muertas (Arnáiz et al, 2000).

Las ventajas de este tipo de recuentos son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfología de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismo vivos de los muertos, es tedioso y no es útil para recuento de poblaciones con baja concentración de microrganismos (Rodríguez et al, 2005).

Una cámara de recuento esta constituida por una placa base de vidrio de tamaño especial parecida a un portaobjetos, su parte central se encuentra separada de los extremos por unas ranuras. En dichas ranuras de encuentran las cuadriculas de recuento cuya forma y disposición dependen de la estructura de fabricación, siendo lo normal que exista una ranura de 0.1 mm entre el campo central y un portaobjetos situado encima.

Referente a la cuadricula de recuento de 0.1mm, podemos decir que existen tres tipos de cuadriculas diferentes:

* Cuadricula de Thomas.

* Cuadricula de Bürker.

* Cuadricula de Neubauer.

La cuadricula más utilizada es la de Neubauer (Silva y García, 2004).

2.2.3.1. Cuadrícula de Thomas

Es un cuadrado de 1 mm de lado, está dividido por la intersección de líneas horizontales y verticales en 400 cuadrados. Existen una serie de líneas que cruzan el centro de cada serie de cuadrados, dividiendo la superficie de la cuadricula en 16 cuadrados pequeños. Estos últimos cuadrados sirven para el recuento de hematíes (Silva y García, 2004).

2.2.3.2. Cuadrícula de Bürker

Consta de 9 cuadrados grandes colocados en 3 hileras con 3 cuadrados cada una. Estos cuadrados grandes están limitados por líneas triples. Cada cuadrado grande tiene la misma superficie que el retículo entero de Thomas. En el interior de estos cuadrados grandes hay 16 cuadrados medianos delimitados

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