Fermentaciones

una fermentación es llevada a cabo por microorganismos anaeróbicos facultativos

METODOS PARA LA DETERMINACION DE LA BIOMASA

Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales (Rodríguez et al, 2005).

En esta perspectiva, en la presente práctica se verá algunos aspectos que deben ser considerados para la determinación de biomasa utilizando un método directo el recuento microscópico.

Por lo tanto el desarrollo de la práctica tiene como objetivo emplear el recuento microscópico para determinar el número de levaduras por mililitro de una muestra de 50 ml al 0.1 % de levadura.

La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso. Ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico.

Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. Los métodos de enumeración celular son métodos de observación, basados en propiedades físicas o en la actividad biológica. Actualmente hay un gran interés en métodos alternativos de determinación de Ia biomasa. Estos métodos son indirectos y estiman algún componente celular o alguna actividad metabólica específica. No requieren el examen visual de los organismos ni su incubación (Arnáiz et al, 2000).

2.2. Métodos directos de determinación de la biomosa

2.2.1. Métodos gravimétricos

La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración.

La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no solo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida. Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles.

Los métodos gravimétricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles (Arnáiz et al, 2000).

2.2.2. Métodos espectrofotométricos

Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el número de células, permitiendo la estimación de tal parámetro a partir de una sola medida de la turbidez.

Se trata de métodos rápidos, pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partículas (Arnáiz et al, 2000).

2.2.3. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras

Existen diversos tipos de cámaras para el recuento de microorganismos tales como la cámara de Neubauer. Thoma, Bürker, Türk, Fuchs-Rosenthal, Malassez, Petroff Hauser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células. ml-1, generalmente).

El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las irregularidades en la distribución de la muestra. Además. Pueden confundirse las células con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células vivas de células muertas (Arnáiz et al, 2000).

Las ventajas de este tipo de recuentos son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfología de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismo vivos de los muertos, es tedioso y no es útil para recuento de poblaciones con baja concentración de microrganismos (Rodríguez et al, 2005).

Una cámara de recuento esta constituida por una placa base de vidrio de tamaño especial parecida a un portaobjetos, su parte central se encuentra separada de los extremos por unas ranuras. En dichas ranuras de encuentran las cuadriculas de recuento cuya forma y disposición dependen de la estructura de fabricación, siendo lo normal que exista una ranura de 0.1 mm entre el campo central y un portaobjetos situado encima.

Referente a la cuadricula de recuento de 0.1mm, podemos decir que existen tres tipos de cuadriculas diferentes:

* Cuadricula de Thomas.

* Cuadricula de Bürker.

* Cuadricula de Neubauer.

La cuadricula más utilizada es la de Neubauer (Silva y García, 2004).

2.2.3.1. Cuadrícula de Thomas

Es un cuadrado de 1 mm de lado, está dividido por la intersección de líneas horizontales y verticales en 400 cuadrados. Existen una serie de líneas que cruzan el centro de cada serie de cuadrados, dividiendo la superficie de la cuadricula en 16 cuadrados pequeños. Estos últimos cuadrados sirven para el recuento de hematíes (Silva y García, 2004).

2.2.3.2. Cuadrícula de Bürker

Consta de 9 cuadrados grandes colocados en 3 hileras con 3 cuadrados cada una. Estos cuadrados grandes están limitados por líneas triples. Cada cuadrado grande tiene la misma superficie que el retículo entero de Thomas. En el interior de estos cuadrados grandes hay 16 cuadrados medianos delimitados por líneas dobles. En la intersección de estas líneas, tanto verticales como horizontales, se forman cuadrados pequeños. En totalidad de la cuadricula existen 169 cuadrados pequeños.

Al igual que en la cuadricula de Thomas, los cuadrados grandes son para el recuento de hematíes y los pequeños para el recuento de leucocitos (Silva y García, 2004)..

2.2.3.3. Cuadrícula de Neubauer

Esta cuadricula de recuento consta de 9 cuadrados grandes de 1mm de lado. Los 4 cuadrados que encontramos en las esquinas están divididos en 16 cuadrados con lados de 0.254 mm. Estos cuadrados se utilizan para el recuento de leucocitos.

El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados medianos de 0.2 mm. Estos cuadrados medianos estan a su vez divididos en 16 cuadrados pequeños de 0.05 mm. Para el recuento de hematíes se utilizan 5 cuadrados medianos.

Existe otro tipo de cámara de Neubauer, la cámara de Neubauer improved, en la cual el cuadrado central esta dividido en 16 cuadrados medianos de 0.25 mm. Estos cuadrados medianos están a su vez divididos en 16 cuadrados pequeños de 0.05 mm (Silva y García, 2004).

2.2.4. Métodos microscópicos mediante epifluorescencia

La microscopía de epifluorescencia comenzó a emplearse a principios de los 70 y hoy en día se considera como uno de los mejores métodos para la estimación de la biomasa. La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adición de algún anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algún componente celular autofluorescente.

Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tinción de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopía óptica con iluminación de epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observación directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedarían englobados aquellos fluorocromos que tras ser adsorbidos actúan específicamente sobre ácidos nucleicos u otros componentes celulares. El segundo incluiría a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad metabólica, son convertidos en moléculas fluorescentes.

AI primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimación de la población total de una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estos fluorocromos permiten distinguir células de partículas e identificar bacterias no sólo por su color, sino también por su forma y tamaño.

El naranja de acridina colorea tanto el ADN como eI ARN de las células emitiendo a una longitud de onda aproximada de 470 nm. Los ácidos nucleicos de hebra simple secolorean de un color naranja-rojo fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan un color verde fluorescente. EI fluorocromo DAPI es un colorante específico del ADN y su pico de excitación se encuentra próximo a la región ultravioleta (365 nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre las células muertas, metabólicamente inactivas, y las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en células muertas.

El quelato de

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