Cristalización de proteínas

Práctica nº 5: Cristalización de proteínas

Claudia Machicado. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular & Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos. Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza

1. INTRODUCCION

La característica principal de un cristal es su estructura interna periódica y ordenada en tres dimensiones. El hecho de que un sistema renuncie a sus grados de libertad parece una contradicción desde el punto de vista entrópico y, sin embargo, la cristalización de moléculas es un fenómeno espontáneo y reversible cuyos parámetros cinéticos y termodinámicos dependen de las propiedades químicas y físicas del solvente y del soluto involucrados. La cristalización se produce cuando, bajo ciertas condiciones (de supersaturación), el sistema se dirige hacia el estado de equilibrio entre dos fases, una soluble y una sólida. A pesar de que las moléculas individuales pierden libertad rotacional y translacional, disminuyendo así la entropía del sistema, establecen al mismo tiempo nuevas interacciones. Esto reduce la energía libre del sistema y provée la fuerza directriz del proceso de ordenamiento. Las moléculas, por tanto, cristalizan minimizando su energía libre al disponerse periódicamente en unidades repetitivas y simétricas en el estado sólido, maximizando las interacciones intermoleculares favorables.

La solvatación es un factor vital para la cristalización de macromoléculas. En soluciones extremadamente concentradas, donde no hay agua suficiente para mantener la hidratación, las moléculas pueden o bien agregar como un precipitado amorfo o bien cristalizar (figura 1). La estrategia para inducir la cristalización consiste en llevar al sistema hacia el estado de mínima solubilidad lentamente y lograr así un grado limitado de supersaturación. Para lograr que las moléculas tengan oportunidad de formar el mayor número de interacciones favorables con los vecinos se modifican las propiedades del solvente con agentes precipitantes o se alteran algunas propiedades físicas como la temperatura.

2. MÉTODOS PARA CRISTALIZAR

La determinación de la estructura cristalográfica empieza con el crecimiento de un cristal adecuado. Para ello pueden aplicarse distintos métodos que se diferencian por las condiciones y solutos que emplean. Para decidir el método mejor para cristalizar una proteína determinada debemos entender los fundamentos de la cristalización.

La formación de un cristal de proteína macroscópico que contiene hasta 1015 moléculas, empieza con la aparición de agregados de proteína mediante contactos intermoleculares (agregación). Estos agregados prenucleares eventualmente alcanzan el tamaño nuclear crítico. Una vez formado un núcleo estable (nucleación), el crecimiento prosigue por la adición de moléculas a la red cristalina. Tanto la nucleación del cristal como el crecimiento ocurren en soluciones supersaturadas donde la concentración de proteína es mayor que su valor de solubilidad en equilibrio. La región del parámetro de solución aconsejable para la cristalización viene recogida en el diagrama de fase (figura 2).

La supersaturación es una función de la concentración de la macromolécula y de diversos parámetros que afectan su solubilidad. En general, se logra a altas concentraciones de macromoléculas y a valores crecientes de parámetros de solución reductores de la solubilidad macromolecular. Los factores que pueden influir en la solubilidad proteica son por ejemplo, la inclusión de aditivos tales como alcoholes, polímeros hidrofílicos y detergentes que puedan disminuir la solubilidad proteica. Estos son agentes precipitantes ya que influyen en la solubilidad, pudiendo causar la precipitación macromolecular. Otro factor que influye sobre la solubilidad proteica es la presencia de sal, que varía generalmente como una curva asimétrica en forma de campana indicando que la solubilidad decrece tanto a altas como a bajas concentraciones de sal. Parámetros de la solución tales como pH o temperatura también pueden afectar dramáticamente a la solubilidad macromolecular.

Las condiciones de supersaturación óptimas para la nucleación y para el crecimiento del cristal son diferentes. Esto se muestra en el diagrama de fase donde la región de supersaturación es además dividida en regiones de más alta supersaturación (región lábil) donde tanto el crecimiento como la nucleación ocurren y la disminución de supersaturación (fase metastable) donde sólo se alcanza el crecimiento.

El método de cristalización más simple.

Los métodos de cristalización en baño (“batch”) consisten mezclar y dejar reposar todos los componentes en una sola solución. La técnica puede miniaturizarse sumergiendo gotas pequeñas de proteína dentro de un aceite inerte. Este método funciona bien con la lisozima de huevo, catalasa y citocromo c554.

Separación del proceso de nucleación y crecimiento.

Dado que las condiciones ideales para la nucleación y crecimiento difieren, una estrategia lógica de cristalización involucra la optimización separada de esos procesos. Esto puede lograrse por siembra (“seeding”), una técnica donde los cristales son transferidos de condiciones de nucleación a aquellas que sólo soportan el crecimiento.

Métodos de cristalización que permiten nucleación transitoria y localizada en soluciones supersaturadas que promueven sólo el crecimiento.

Estos métodos se basan en la capacidad de alcanzar condiciones de nucleación transitoria o local en una solución suficientemente supersaturada, que por el contrario promueve sólo el crecimiento. La temperatura de la solución es inicialmente ajustada para inducir la nucleación, y posteriormente cambiada para disminuir la supersaturación y permitir solo el crecimiento.

Métodos de diálisis.

Como los métodos de baño, la concentración macromolecular permanece constante durante la cristalización por diálisis. La diferencia es que en este método la composición de la solución es alterada difundiendo componentes de bajo peso molecular a través de una membrana semi-impermeable.

Métodos de difusión de vapor.

Las condiciones dentro de una solución que contiene proteína son manipuladas mediante la difusión a través del aire (figura 3). Como con los otros métodos de cristalización, el objetivo inicial es formar núcleos. En este método, la nucleación ocurre cuando se aumenta la concentración de proteína por medio de la reducción del volumen de la solución.

...