INVESTIGACIÓN SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CATECOLASA.

PRÁCTICA 5.

INVESTIGACIÓN SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CATECOLASA.

INTRODUCCIÓN.

Durante esta práctica se estudiará la actividad de la enzima catecolasa contenida en algunas frutas y vegetales. Las papas peladas y las frutas machucadas se tornan cafés cuando son expuestas al aire debido a que la catecolasa facilita una reacción entre el catecol y el oxígeno. En presencia de oxígeno, el catecol es oxidado por la remoción de dos átomos de hidrógeno. El catecol es así convertido en benzoquinona, y el oxígeno es reducido por la adición de dos átomos de hidrógeno para formar agua. Las moléculas de benzoquinona se unen luego para formar cadenas largas y ramificadas. Estas cadenas son la base estructural de los pigmentos melanoides rojo y café que causan el oscurecimiento.

OBJETIVOS.

• Determinar los efectos de la temperatura sobre la actividad enzimática catecolasa.

• Determinar los efectos del pH sobre la actividad enzimática catecolasa.

• Describir los efectos del cambio en la concentración de enzima sobre la tasa de reacción catalizada por la enzima.

• Describir la relación entre la concentración de sustrato y la máxima velocidad de la reacción enzimática.

Nota: tenga en mente que, aunque esté utilizando jugo de papa en estos experimentos, Usted está en realidad trabajando con un extracto enzimático.

MATERIAL.

Por equipo.

 26 tubos 16 x 150

 75 mL de jugo de papa (guardar en frasco ámbar)

 Baño de hielo

 Baño maría

 Termómetro

 200 mL de buffer de fosfatos pH 7.0, 0.01 M

 10 mL de cada uno de los siguientes buffer de fosfatos (0.01 M): pH 4.0, 6.0, 8.0, 10.0

 50 mL de solución de catecol 0.05 M (guardar en frasco ámbar y evitar contacto con la luz y aire)

 2 goteros

 Parafilm

PROCEDIMIENTO.

PARTE I. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Como la mayoría de las reacciones químicas, la tasa de reacción de una reacción catalizada enzimáticamente se incrementa al incrementar la temperatura hasta un punto en el cual la tasa es máxima. Después la tasa de reacción declina abruptamente al seguir incrementando la temperatura. Por encima de 400C la mayoría de las enzimas en los tejidos vivos se desnaturalizan, es decir, pierden su estructura secundaria o terciaria.

1. Llene tres tubos con 3 mL de buffer de fosfatos de pH 7. Etiquete los tubos como “10”, “25” y “50”.

2. Coloque el primer tubo en un baño de hielo, deje el segundo tubo a temperatura ambiente y coloque el tercer tubo en baño maría (aproximadamente 500C). Mientras tanto continúe con el paso 3.

3. Tome tres tubos conteniendo jugo de papa y coloque uno en baño de hielo, otro a temperatura ambiente y uno más en baño maría. Haga lo mismo con tres tubos conteniendo catecol.

4. Después de 10 minutos, añada 10 gotas de catecol (a temperatura ambiente) a cada tubo de buffer.

5. Añada diez gotas de jugo de papa (a temperatura ambiente) a cada tubo.

6. Espere 5 minutos (agite las mezclas varias veces durante este tiempo). Registre sus resultados en la tabla 1 indicando la intensidad del color en cada tubo después de los 5 minutos (0 indica sin color; +, ++ y +++ indican incremento en la intensidad del color).

Tabla 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Tipo de tubo Intensidad de color

10 25 50

Buffer

Jugo de papa

Catecol

Actividades:

a. ¿A qué temperatura fue mayor la cantidad de producto obtenido en la reacción enzimática?

b. ¿Cómo podría relacionarse la cantidad de producto formado por minuto con la tasa de reacción enzimática?

c. ¿Cuál fue el objeto de agitar los tubos?

d. ¿A qué temperatura fue mayor la tasa de reacción? Grafique sus resultados (temperatura en la abscisa y tasa de reacción en la ordenada).

e. Colocar papas peladas en hielo antes de cocinarlas previene su oscurecimiento. ¿Por qué?

PARTE II. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

La presencia de diversos iones puede interferir con los patrones de cargas positivas y negativas en una molécula de proteína, cambiando así la configuración de la misma. En una enzima, la forma del sitio activo puede ser cambiada. Nosotros debemos esperar, por lo tanto, que cambios en el pH afectarán la actividad de las enzimas.

El valor de pH más favorable, el punto en el cual la enzima es más activa, se conoce como pH óptimo. Valores de pH extremadamente altos o bajos resultan usualmente en le pérdida de la actividad enzimática debido a la desnaturalización de la enzima.

1. Etiquete cinco tubos con los siguientes valores de pH: 4, 6, 7, 8 y 10.

2. Llene cada tubo con 3 mL del correspondiente buffer de fosfatos y agregue 10 gotas de jugo de papa.

3. Añada 10 gotas de catecol a cada tubo. Cubra el tubo con parafilm e invierta varias veces para mezclar el contenido.

4. Esté preparado para observar cambio en color. Espere de 3 a 5 minutos. Invierta la mezcla de cada tubo a intervalos de 1 minuto. La tasa de reacción enzimática (medida por la cantidad de producto formado durante un periodo dado de tiempo) será cualitativamente proporcional

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