EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO Y ELECTROFORESIS DE DNA

“Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia”

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Facultad de Ciencias y Filosofía “Alberto Cazorla Talleri” Departamento académico de ciencias exactas

EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO Y ELECTROFORESIS DE DNA

DOCENTE:

• Barreto Gaviria Teresa Victoria.

2021-2

1. INTRODUCCIÓN SOBRE EL TEMA TRATADO (CITAR REFERENCIAS UTILIZADAS)

2. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: LA RESPUESTA PARA CADA EJERCICIO DEBE TENER FUNDAMENTO CIENTÍFICO Y REFERENCIA(S) DE RESPALDO.

PARTE I

Extracción del DNA plasmídico – (“Miniprep”)

1. Revisar el siguiente video:

https://www.youtube.com/watch?v=m5FfyCgDMQo (Biorad).

a) ¿Por qué se utiliza ampicilina en el medio de cultivo?

Para asegurarnos de que el cultivo no se encuentre contaminado con organismos no deseados.

b) ¿Qué pasos de la extracción de ADN plasmídico puede identificar? Realice un flujograma del procedimiento mostrado en el video.

Se identificaron todos los pasos de extracción de ADN en el video. Previamente, se encuentran los pasos para el cultivo, para la incubación y la centrifugación de la suspensión de bacterias.

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c) ¿Cuál es el propósito de agregar la solución II en el procedimiento realizado?

La solución II es responsable de lisar membranas y las interacciones entre macromoléculas, para así liberar el material que se desea aislar.

d) ¿Qué cambios se observan en el tubo cuando se agrega esta solución II? Explique a qué se debe estos cambios.

La claridad de la suspensión aumenta, debido a que se está llevando a cabo la lisis, por lo que las partículas que se interponen a la luz son más pequeñas.

e) ¿Qué cambios se observan en el tubo cuando se agrega la solución III? Explique a qué se debe estos cambios.

Al adicionar y mezclar con la solución III, se observa que la turbidez aumenta repentinamente. Esto es debido a que las macromoléculas no vuelven a su estado inicial, o sea, no se renaturan correctamente.

2. Revise el protocolo que se encuentra en el anexo 1.

a) ¿Según el protocolo del anexo 1, a partir de qué células se realiza la extracción del plásmido pUC18?

E. coli DH5-pUC18 (describir la cepa)

b) Describa la composición de las soluciones I, II y III.

Solución I:  50mM Glucosa, EDTA 10mM, 25mM, Tris HCl pH 8.0

Solución II: 0.2N NaOH, 1% SDS

Solución III: 60 mL de Acetato de Potasio 5M, 11.5mL de Ácido Acético Glacial pH 4.8, 28.5mL de agua Milli Q

c) ¿Cómo se realiza la precipitación del ADN plasmídico?

Se agrega 2 volúmenes de etanol absoluto y se agita mediante inversión y se deja reposar por 10 min a temperatura ambiente.

d) ¿Qué diferencias encuentra con la metodología revisada en el video?

En la metodología del video no se hace precipitación de ADN al final, sinó que se purifica el ADN con columnas de sílica.

e) ¿Qué ventajas y desventajas encuentra entre los dos procedimientos?

f) ¿Cómo podría incluir la metodología de extracción orgánica en el protocolo de lisis alcalina y para qué serviría?

Se podría utilizar un buffer de extracción contiene propinada K. Este buffer hace que elimine con mayor eficiencia algunas impurezas.

PARTE II

Electroforesis de DNA

1. Revisar el siguiente video: https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw&feature

=youtu.be (Pérez De Castro Ana María, Universitat Politècnica de València UPV) y el protocolo descrito a continuación. Luego responda las siguientes preguntas:

➢ ¿Qué es la agarosa?

Es un polisacárido que se usa para construir geles que permiten separar moléculas de ADN, mediante electroforesis. Se usa esta técnica porque es sencilla y no se necesitan grandes cantidades de colorante para diferenciar el tamaño de los fragmentos.

➢ ¿Cuál es la función del buffer TBE 0.5X? Describa la composición del buffer.

Es para mantener el pH en 8. Su composición es de 0.45 M Tris Base, 0.45 M Ácido Bórico, 10 mM EDTA

➢ ¿Cuál es la función del buffer de carga? Describa su composición.

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