DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA G E N É T I C A M I C R O B I A N A AISLAMIENTO DE DNA.
Enviado por MoniqDiaz • 19 de Septiembre de 2016 • Informes • 2.822 Palabras (12 Páginas) • 355 Visitas
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 1][pic 2]
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
G E N É T I C A M I C R O B I A N A
Práctica 1
[pic 3]
Contenido
Introducción
Objetivos
Resultados
Discusión
Conclusión
Bibliografía
Introducción
El descubrimiento de la molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) en 1944 por Avery Macleod and McCarty, es quizá, el inicio del entendimiento de como la genética marca lo que es ser vivo y esto se entiende aún mejor con la doble hélice del DNA descrita por Watson y Crick en 1953, y posteriormente con la contribución de grandes investigadores para comprender la interpretación del código genético. A partir de entonces hay un inmenso desarrollo técnico que permite unir diferentes investigaciones hasta llegar a la compresión de que la secuencia de nucleótidos nos dará el orden de aminoácidos para conformar una proteína, que a su vez será una proteína estructural o con alguna función y la interacción de estas al final resultara en el todo de un ser vivo tan sencillo como los unicelulares o los más complejos como mamíferos. Precisamente la esencia unicelular de las bacterias las ha convertido en un excelente modelo de estudio de genética para entender cómo se regulan sus genes para estos se expresen y den al final la capacidad de producir moléculas que rigen la vida.
El material genético de las bacterias se encuentra en forma de ácido desoxirribonucleico (DNA) y posteriormente tenemos los elementos conocidos como ácidos ribonucleicos (RNA) en sus diferentes tipos: de transferencia y ribosomal.
El DNA bacteriano es una molécula compuesta por unidades repetitivas de nucleótidos. Cada nucleótido está formado por una base nitrogenada (Adenina, Timina, Guanina o Citosina) con desoxirribosa (azúcar y pentosa) y un grupo fosfato. Los nucleótidos están unidos en pares por puentes de hidrogeno a lo largo de cadenas enrolladas en forma de doble hélice y unidos a proteínas. Este DNA conforma el genoma bacteriano, aunque también puede encontrarse en elementos extracromosómicos como los plásmidos, transposones e integrones. (Negroni, 2009)
Los métodos de extracción de DNA se remontan a 1869 cuando Miescher consiguió extraer esperma de salmón o de los leucocitos humanos, lo que entonces denomino nucleina y que hoy en día sabemos que es DNA.
Uno de los métodos más utilizados para aislar el DNA (en este caso de una muestra de sangre) consiste en lisar las células a través de un choque hipotónico y en presencia de detergentes para eliminar el exceso de hemoglobina. Posteriormente se tratan los núcleos de los leucocitos con Proteinasa K y se procede a la purificación del DNA a través de extracción clorofórmica de proteínas y precipitación del DNA con etanol.
El DNA de esta forma es apto para la mayoría de técnicas de análisis genético molecular. Aparte de este método existen numerosas variantes metodológicas para purificar el DNA dependiendo del material de partida (sangre, tejidos, bacterias y levaduras) basado en solubilidad o precipitación diferencial del DNA o basado en su afinidad a distintos tipos de matrices. (Rafael Oliva et al, 2008)
En la actualidad es posible analizar algunas características de la molécula del DNA en poco tiempo y de manera precisa, gracias al desarrollo de equipos de alta precisión y la aplicación de la información a la biología. Lo que ha permitido diseñar nuevas metodologías y programas de computación para el estudio de los ácidos nucleicos. Como ejemplo de lo anterior, en esta práctica se analizaran algunos parámetros que pueden influir sobre la temperatura de desnaturalización de oligodesoxirribonucleótidos mediante el uso de un programa computacional.
Objetivos
- Aislar DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de un cultivo bacteriano y/o de un lisado fágico.
- Establecer el espectro de absorción del DNA aislado
- Determinar la concentración y grado de pureza del DNA obtenido.
- Determinar la influencia de algunas características de la secuencia del DNA sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático DNAMAN.
Resultados
- AISLAMIENTO DE DNA
A continuación se resumen los fundamentos de cada paso de la técnica utilizados para el desarrollo de aislamiento de DNA cromosómico de un microorganismo Gram Negativo (cepa W3350 de E.coli).
Tabla No. 1 Fundamentos de los pasos de la técnica para el aislamiento de DNA cromosómico de un microorganismo Gram Negativo.
REACTIVO | SITIO DE INTERACCION | FUNDAMENTO |
Tris 50mM/EDTA 20mM | Células Bacterianas | TRIS: mantiene la regulación del medio a pH entre 7.6 y 9.0 EDTA (Ácido etilendiaminotetraacetico): es un quelante iones metálicos como del cofactor Mg+ bajando su concentración e inhibiendo a las nucleasas |
RNAsa (10mg/mL) | Células Bacterianas | Degradación del RNA intracelular |
Lisozima (50mg/mL) | Pared Celular | La lisozima interactúa con la pared celular hidrolizando el enlace β-1,4 entre los residuos de N-acetil murámico y N-acetil-D-glucosamida, lo que expone a la membrana y la hace susceptible a degradación por detergentes. |
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 10% | Membrana Celular | Una vez expuesta la membrana, es degradada por el detergente SDS que por su naturaleza antipática desestabiliza a los fosfolípidos de la misma. Simultáneamente al liberarse el contenido celular la RNAsa que todavía está en el medio degrada el RNA de la suspensión, dejando solo al ADN |
Tris 10mM/EDTA 1mM | A menor concentración para evitar afectar el rendimiento de la reaccion, puesto que ya se había adicionado anteriormente para garantizar la estabilidad del pH. De la misma manera el EDTA secuestra a los iones metálicos de la solución, inhibiendo a las nucleasas liberadas con la lisis celular. | |
NaCl 5M | La sal cloruro de sodio disminuye la constante dieléctrica del DNA al interactuar con el agua que esta solvatando al DNA para facilitar su precipitación y separación. | |
Fenol Saturado | Proteínas | Algunas moléculas de fenol aproximadamente el 20% se disuelven en agua. Sin embargo las moléculas de fenol son extremadamente hidrofóbicas. En consecuencia tiende a ser más solubles en la parte hidrofóbica de las proteínas, haciendo que las proteínas se desnaturalicen siendo más solubles en fenol que en agua. Como resultado se separan las proteínas de los ácidos nucleicos dejándolos en la fase acuosa del medio. Los ácidos nucleicos no tienen grupos hidrofóbicos en absoluto y son insolubles en la fase orgánica con fenol. Dado que solo cantidades relativamente pequeñas de proteína pueden disolverse en un volumen dado de fenol, se requiere la extracción repetida de la fase acuosa con fenol a fin de eliminar la mayor cantidad de proteína posible. |
Cloroformo- Alcohol Isoamilico (21:1) | Proteínas | Este paso completa la remoción de proteínas, por la acción desnaturalizante del cloroformo (compuesto orgánico) y lava a las células retirando el fenol que se usó anteriormente en las extracciones |
Isopropanol frio | DNA | Ayuda a la precipitación del DNA al disminuir la constante dieléctrica del mismo. |
Etanol al 70% frio | DNA | El etanol es completamente miscible con agua, sin embargo, es mucho menos polar que el agua. El Etanol no puede interactuar con los grupos polares de ácidos nucleicos tan fuertemente como el agua, la producción de etanol un disolvente muy pobre para los ácidos nucleicos. La sustitución de 95 por ciento de las moléculas de agua en una solución de ADN Hará que el ADN precipite. |
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