Aborto.

Efectos de cucurbitacinas sobre la morfología celular se asocian con la sensibilización de células de carcinoma renal a la apoptosis inducida por TRAIL

Curtis J. Henrich , autor principal Cheryl L. Thomas , Alan D. Brooks, Nancy Lynn Booth, Evan M. Lowery, Richard J. Pompei , James B. McMahon, y Thomas J. Sayers

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abstracto

Cucurbitacinas B y D estaban entre los compuestos identificados como sensibilizadores de células cancerosas a la apoptosis mediada por TRAIL en una pantalla de alto rendimiento . Por lo tanto una serie de cucurbitacinas se investigó más para la sensibilización TRAIL y los posibles mecanismos de acción . Un total de seis cucurbitacinas promovido la apoptosis inducida por TRAIL (B , I, E , C , D y K) y una ( P ) fue inactivo. Sensibilización de células de adenocarcinoma renal a TRAIL era evidente después de tan poco como 1-4 h de pretratamiento y no requiere la presencia continua de cucurbitacina . Cucurbitacinas activa la caspasa- 8 inducida por la activación sólo después de la adición TRAIL posterior y la activación de la caspasa se requiere para la apoptosis sugiere de señalización proximal amplificados a partir de los receptores de muerte TRAIL . Cucurbitacina - sensibilizado citotoxicidad inducida por TRAIL fue inhibida por N-acetil cisteína . Análisis de la relación estructura-actividad en comparación con los estudios publicados sugiere que las actividades citotóxicas TRAIL- sensibilizantes y generales de cucurbitacinas pueden disociar . Cucurbitacinas son reportados a ser inhibidores de la activación de STAT3 . Sin embargo , su actividad TRAIL es sensibilizante es STAT3 - independiente. Tratamiento del carcinoma de células renales con cucurbitacinas activos produjo cambios rápidos y dramáticos en la morfología celular y la organización del citoesqueleto (también impedida por NAC ) . Por lo tanto , cucurbitacinas pueden ser útiles como herramientas para investigar el mecanismo molecular ( s ) de la acción de sensibilizadores TRAIL , particularmente con respecto a los aspectos temporales de la sensibilización y la modulación de la señalización por TRAIL morfología de las células , y podrían formar la base para el futuro desarrollo terapéutico en combinación con agonistas de los receptores de muerte TRAIL .

Palabras clave : cucurbitacinas , TRAIL, TRAIL sensibilizadores , apoptosis, STAT3 , la morfología de la célula

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introducción

La inducción de la apoptosis de las células del cáncer - específica a través de la activación de TRAIL (tumor relacionado con el factor ligando inductor de apoptosis de la necrosis ) de señalización se ha convertido en un foco importante de la investigación del cáncer [ 1-5 ] . Ante la ocurrencia relativamente común de resistencia TRAIL en muchos tipos de cáncer [ 6-9 ] , la búsqueda de potenciadores de la muerte celular inducida por TRAIL se ha extendido (ver comentarios citados arriba). Esto ha resultado en la identificación de muchos compuestos con una gama muy amplia de mecanismos moleculares putativo de acción [ 1 ] . Una campaña de cribaje de alto rendimiento reciente de la utilización de la relativamente resistente a TRAIL carcinoma de células renales línea ACHN dio como resultado la identificación de una serie de sensibilizadores TRAIL sinérgicos , incluyendo cucurbitacinas B y D [ 10 ] . Cucurbitacinas , los miembros de un grupo de triterpenoides tetracíclicos producidas por las plantas de la familia de las cucurbitáceas , de largo se han notificado a tener efectos contra el cáncer a través de varios mecanismos potenciales de acción [ 11 ] . Cucurbitacinas están particularmente bien caracterizados en términos de su capacidad para modular la señalización JAK2/STAT3 [ 11-13 ] y cucurbitacina B ha sido informado recientemente para activar la generación de especies reactivas de oxígeno ( ROS ) en las células [ 14 ] . JAK2/STAT3 moduladores de señales, incluyendo cucurbitacina I [ 15 ] , sorafenib [ 16 ] , y tirfostina AG490 [ 17 , 18 ] han informado a mejorar celular inducida por TRAIL matar en una variedad de células cancerosas . Del mismo modo , ciertos otros sensibilizadores de TRAIL se han notificado a requerir la generación de ROS para la actividad [ 5 , 19-21 ] . Para investigar más a fondo los efectos de cucurbitacinas , se evaluaron una serie de siete compuestos utilizando células de carcinoma renal para su actividad de sensibilización TRAIL , los efectos sobre la activación de STAT3 , la sensibilidad a la ROS modulador de N-acetilcisteína ( NAC ) y los efectos sobre la morfología celular.

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Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

Cucurbitacinas se obtuvieron del Programa de Desarrollo Terapéutica NCI (DTP ) y / o de ChromaDex (Irvine , CA- cucurbitacinas B , D , E, y yo solamente) . 2,3 - Bis ( 2 - metoxi - 4 - nitro - 5 - sulfofenil ) -5 - [ ( fenilamino ) carbonil] hidróxido - 2H - tetrazolio ( XTT ; NSC 601519 ) fue proporcionada por la síntesis de drogas y Rama Química , DTP / Instituto Nacional del Cáncer ( Frederick , MD). Bortezomib se adquirió de los Institutos Nacionales de la Salud Farmacia . Recombinante ligando TRAIL ( 168 ácido TNF dominio homólogo extracelular amino ) se adquirió de Peprotech , Inc. (Rocky Hill, NJ ) . Los medios de comunicación y aditivos de cultivo de células se obtuvieron a partir Cellgro ( Manassas , VA ) , Hyclone ( Logan , UT ) , Sigma ( St. Louis , MO ) o Invitrogen ( Carlsbad , CA ) . Kits de ensayo de proteínas BCA se obtuvieron de Pierce / Thermo ( Rockford , IL ) . Otros productos químicos y reactivos se obtuvieron de Sigma ( St. Louis , MO ) . Las estructuras químicas se elaboraron usando ChemDraw ( CambridgeSoft Corp. , Cambridge , MA ) utilizando información estructural de la base de datos PubChem ( http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ) .

Los anticuerpos , reactivos de Western blot

Anti - caspasa - 8 ( 18C8 monoclonal de conejo ) , y anti - phosphopaxillin ( Tyr118 ) se obtuvieron de Tecnología de Señalización Celular ( Danvers , MA ) . Anti - GAPDH ( G8795 monoclonal de ratón ) , conjugado con peroxidasa de rábano picante , fue de Sigma . Anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante

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