Efectos de cucurbitacinas sobre la morfología celular

Efectos de cucurbitacinas sobre la morfología celular se asocian con la sensibilización de células de carcinoma renal a la apoptosis inducida por TRAIL

Curtis J. Henrich , autor principal Cheryl L. Thomas , Alan D. Brooks, Nancy Lynn Booth, Evan M. Lowery, Richard J. Pompei , James B. McMahon, y Thomas J. Sayers

Información Autor ► Información de copyright y licencia ►

Versión final editada del editor de este artículo está disponible en la apoptosis

Ver otros artículos del PMC que citan el artículo publicado .

Ir a:

abstracto

Cucurbitacinas B y D estaban entre los compuestos identificados como sensibilizadores de células cancerosas a la apoptosis mediada por TRAIL en una pantalla de alto rendimiento . Por lo tanto una serie de cucurbitacinas se investigó más para la sensibilización TRAIL y los posibles mecanismos de acción . Un total de seis cucurbitacinas promovido la apoptosis inducida por TRAIL (B , I, E , C , D y K) y una ( P ) fue inactivo. Sensibilización de células de adenocarcinoma renal a TRAIL era evidente después de tan poco como 1-4 h de pretratamiento y no requiere la presencia continua de cucurbitacina . Cucurbitacinas activa la caspasa- 8 inducida por la activación sólo después de la adición TRAIL posterior y la activación de la caspasa se requiere para la apoptosis sugiere de señalización proximal amplificados a partir de los receptores de muerte TRAIL . Cucurbitacina - sensibilizado citotoxicidad inducida por TRAIL fue inhibida por N-acetil cisteína . Análisis de la relación estructura-actividad en comparación con los estudios publicados sugiere que las actividades citotóxicas TRAIL- sensibilizantes y generales de cucurbitacinas pueden disociar . Cucurbitacinas son reportados a ser inhibidores de la activación de STAT3 . Sin embargo , su actividad TRAIL es sensibilizante es STAT3 - independiente. Tratamiento del carcinoma de células renales con cucurbitacinas activos produjo cambios rápidos y dramáticos en la morfología celular y la organización del citoesqueleto (también impedida por NAC ) . Por lo tanto , cucurbitacinas pueden ser útiles como herramientas para investigar el mecanismo molecular ( s ) de la acción de sensibilizadores TRAIL , particularmente con respecto a los aspectos temporales de la sensibilización y la modulación de la señalización por TRAIL morfología de las células , y podrían formar la base para el futuro desarrollo terapéutico en combinación con agonistas de los receptores de muerte TRAIL .

Palabras clave : cucurbitacinas , TRAIL, TRAIL sensibilizadores , apoptosis, STAT3 , la morfología de la célula

Ir a:

introducción

La inducción de la apoptosis de las células del cáncer - específica a través de la activación de TRAIL (tumor relacionado con el factor ligando inductor de apoptosis de la necrosis ) de señalización se ha convertido en un foco importante de la investigación del cáncer [ 1-5 ] . Ante la ocurrencia relativamente común de resistencia TRAIL en muchos tipos de cáncer [ 6-9 ] , la búsqueda de potenciadores de la muerte celular inducida por TRAIL se ha extendido (ver comentarios citados arriba). Esto ha resultado en la identificación de muchos compuestos con una gama muy amplia de mecanismos moleculares putativo de acción [ 1 ] . Una campaña de cribaje de alto rendimiento reciente de la utilización de la relativamente resistente a TRAIL carcinoma de células renales línea ACHN dio como resultado la identificación de una serie de sensibilizadores TRAIL sinérgicos , incluyendo cucurbitacinas B y D [ 10 ] . Cucurbitacinas , los miembros de un grupo de triterpenoides tetracíclicos producidas por las plantas de la familia de las cucurbitáceas , de largo se han notificado a tener efectos contra el cáncer a través de varios mecanismos potenciales de acción [ 11 ] . Cucurbitacinas están particularmente bien caracterizados en términos de su capacidad para modular la señalización JAK2/STAT3 [ 11-13 ] y cucurbitacina B ha sido informado recientemente para activar la generación de especies reactivas de oxígeno ( ROS ) en las células [ 14 ] . JAK2/STAT3 moduladores de señales, incluyendo cucurbitacina I [ 15 ] , sorafenib [ 16 ] , y tirfostina AG490 [ 17 , 18 ] han informado a mejorar celular inducida por TRAIL matar en una variedad de células cancerosas . Del mismo modo , ciertos otros sensibilizadores de TRAIL se han notificado a requerir la generación de ROS para la actividad [ 5 , 19-21 ] . Para investigar más a fondo los efectos de cucurbitacinas , se evaluaron una serie de siete compuestos utilizando células de carcinoma renal para su actividad de sensibilización TRAIL , los efectos sobre la activación de STAT3 , la sensibilidad a la ROS modulador de N-acetilcisteína ( NAC ) y los efectos sobre la morfología celular.

Ir a:

Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

Cucurbitacinas se obtuvieron del Programa de Desarrollo Terapéutica NCI (DTP ) y / o de ChromaDex (Irvine , CA- cucurbitacinas B , D , E, y yo solamente) . 2,3 - Bis ( 2 - metoxi - 4 - nitro - 5 - sulfofenil ) -5 - [ ( fenilamino ) carbonil] hidróxido - 2H - tetrazolio ( XTT ; NSC 601519 ) fue proporcionada por la síntesis de drogas y Rama Química , DTP / Instituto Nacional del Cáncer ( Frederick , MD). Bortezomib se adquirió de los Institutos Nacionales de la Salud Farmacia . Recombinante ligando TRAIL ( 168 ácido TNF dominio homólogo extracelular amino ) se adquirió de Peprotech , Inc. (Rocky Hill, NJ ) . Los medios de comunicación y aditivos de cultivo de células se obtuvieron a partir Cellgro ( Manassas , VA ) , Hyclone ( Logan , UT ) , Sigma ( St. Louis , MO ) o Invitrogen ( Carlsbad , CA ) . Kits de ensayo de proteínas BCA se obtuvieron de Pierce / Thermo ( Rockford , IL ) . Otros productos químicos y reactivos se obtuvieron de Sigma ( St. Louis , MO ) . Las estructuras químicas se elaboraron usando ChemDraw ( CambridgeSoft Corp. , Cambridge , MA ) utilizando información estructural de la base de datos PubChem ( http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ) .

Los anticuerpos , reactivos de Western blot

Anti - caspasa - 8 ( 18C8 monoclonal de conejo ) , y anti - phosphopaxillin ( Tyr118 ) se obtuvieron de Tecnología de Señalización Celular ( Danvers , MA ) . Anti - GAPDH ( G8795 monoclonal de ratón ) , conjugado con peroxidasa de rábano picante , fue de Sigma . Anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante se compraron de Thermo Scientific ( Rockford , IL ) .

Células y condiciones de cultivo de células

Caki - 1 células renales ACHN ( Instituto Nacional del Cáncer , Frederick , MD ) ACHN y se mantuvieron en cultivo y se prepararon para los ensayos tal como se describe [ 10 ] .

Los ensayos de citotoxicidad sensibilización / TRAIL

ACHN células se trataron con tripsina , se transfirió a limpiar placas tratadas de cultivo de tejido de 384 pocillos ( BD Biosciences , San Jose , CA) a 3500 células por pocillo en claro ( sin rojo de fenol ) y se dejó en medio unieran durante la noche . Los compuestos se diluyeron en medio ( a 10-20 × concentración final ) y se añadieron a placas que contienen las células ACHN . Después de 1-4 horas de incubación , se añadió TRAIL ( 40 ng / ml concentración final ) o medio de control . Después de 18-20 h , el número de células se evaluó mediante un ensayo XTT tal como se describe [ 10 ] . El número de células a partir del ensayo XTT se normalizaron a los controles tratados con DMSO . Para el experimento de lavado de salida , se retiró el medio que contiene el compuesto y las células se lavaron ( 45 l / pocillo medio ) antes de la adición de medio fresco con o sin TRAIL . Con el fin de investigar el efecto de ROS en la sensibilización , se añadió NAC ( 10 mM de concentración final ) a las células justo antes de la adición de compuestos . NAC se mantuvo en las placas durante todo el experimento . Después de 4 h con compuestos seguidos de 18 a 20 h con ( o sin ) TRAIL, el número de células se estimó usando el ensayo XTT . En

este caso , se retiró el medio y las células se lavaron con medio fresco antes de la adición de XTT con el fin de eliminar la interferencia en el ensayo debido al reactivo de NAC . En los experimentos que evalúan los efectos del inhibidor de caspasa ZVAD - FMK y el control de inhibidor de caspasa inactiva ZFA - FMK , el número de células se evaluaron utilizando el Promega ( Madison , WI ) ensayo de MTS y se normalizó para la ZVAD - FMK sólo o ZFAFMK sólo según sea apropiado . En algunos experimentos , se estimó el número de células utilizando el CellTiter - Glo Luminescent ensayo de viabilidad celular ( Promega ) siguiendo las instrucciones del fabricante .

Caspasa - 8 ensayos de activación

Se realizó el ensayo de la caspasa - 8 , tal como se describe anteriormente [ 10 ] . Brevemente, las células se sembraron a 7000 células / pocillo en el tejido blanco luminiscencia cultura - tratada placas de 384 pocillos . Alternativamente, en algunos experimentos , se añadieron células ACHN a placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos de luminiscencia blanca como se describe anteriormente [ 22 ] . Después del tratamiento con cucurbitacinas para varios períodos , se añadió TRAIL . Después de diferentes puntos de tiempo , las células se lisaron y la caspasa - 8 actividad se determinó usando el kit de ensayo de 8 ™ caspasa - Glo de Promega ( Madison , WI) según las instrucciones del fabricante . Este ensayo incluyó MG132 con el fin de reducir la señal de fondo debido a la actividad del proteasoma en las células . La correlación del ensayo de luminiscencia con la activación de la caspasa-

...