Activación positiva de expresión génetica

ACTIVACIÓN POSITIVA DE EXPRESIÓN GÉNICA

La mayoría de los activadores de la transcripción bacteriana funcionan al establecer contacto directo con la ARN polimerasa en los promotores diana. Algunos activadores entran en contacto con el dominio carboxi-terminal de la subunidad c ~ de la ARN polimerasa, alguna región de contacto 4 de la subunidad 57o, mientras que otros interactúan con otros sitios de contacto. Varios activadores son ambidiestros y pueden, al parecer simultáneamente, contactar a más de un sitio objetivo en la ARN polimerasa. La expresión de muchos promotores depende conjuntamente de dos o más activadores. Existen varios mecanismos diferentes para acoplar actividad promotora a más de un activador: en uno de tales mecanismos, los diferentes activadores establecen contactos independientes con diferentes sitios diana en la ARN polimerasa.

INTRODUCCION

"La expresión de fuego de la mayoría de los genes bacterianos está regulada al inicio de la transcripción [1]. Esta regulación resulta de factores de transcripción que se unen a promotores o cerca de ellos, activando o reprimiendo la iniciación de la transcripción en respuesta a señales extracelulares [21. En estas revisiones, nos enfocamos sobre los activadores de transcripción y los mecanismos por los que aumentan la frecuencia de iniciación de la transcripción, concentrándose en estudios recientes con los promotores y activadores de Esdzeric / zia co / i que se consideran paradigmas. En la última década, todos los factores de transcripción favoritos tienen se ha caracterizado en detalle: sin embargo, la secuencia completa del genoma recientemente reportada de E. co / i ahora permite un fácil acceso al conjunto completo de estos factores [3 °].

Iniciación de la transcripción y su activación Los promotores bacterianos contienen diferentes elementos que son reconocidos por la ARN polimerasa holoenzima (RNAP) (Figura la). Los elementos hexámeros -10 y -35 se ponen en contacto con superficies específicas en la región 2 y la región 4 de la subunidad RNAP ~ 711, respectivamente [4]. Upstream (UP) -clenlcnts, que se encuentran justo aguas arriba de la región -35 en muchos promotores, se ponen en contacto con el ARN polimerasa ~ subunidad carboxy-terminal dominio (o ~ CTD) [5]. Additionallx 5 en algunos promotores, una extensión aguas arriba del elemento -10 se contacta con una extensión de la región 2 de 0,70 [6]. Diferentes promotores contienen diferentes combinaciones de estos elementos: en algunos casos, el reconocimiento de estos elementos por RNAP es suficiente para permitir la actividad del promotor en ausencia de un activador. pero, en otros casos, se necesita un activador. El activador puede ser necesario para el reclutamiento inicial de RNAP para el promotor, para la isomerización de RNAP de un complejo cerrado a abierto, o para la eliminación del promotor. En todos los protnotcrs dependientes del activador que se han estudiado en detalle, el activador funciona b v facilitando un camino que se sigue en los promotores independientes del activador: los activadores actúan para acelerar las vías preexistentes en lugar de crear nuevas vías.

Dos modelos han dominado nuestro tinkear sobre cómo funcionan los activadores. Un modelo propone que los activadores funcionan bx, haciendo contacto directo con RNAP. El segundo supone que no hay contacto directo entre el activador y RNAR pero que el activador altera la conformación del ADN del promotor para facilitar la iniciación de la transcripción por RNAR. En muchos casos, estudios bioquímicos y genéticos han proporcionado evidencia de que los activadores hacen contacto directo con RNAP ( para una visión general ver [7 °°]). Los estudios de huellas han demostrado que estos activadores se unen inmediatamente a RNAP en promotores objetivo, y que la unión es cooperativa, mientras que los estudios genéticos han llevado a la identificación de sustituciones de control positivas (estos son cambios de aminoácidos únicos en los activadores que dan como resultado defectos de activación sin afectar la unión al ADN). Estas sustituciones mapean la superficie del activador que hace contacto con RNAP. Las superficies de contacto análogas en las diferentes subunidades de RNAP para activadores específicos se han identificado luego a partir de la ubicación de sustituciones de aminoácidos individuales que interfieren con la activación. Algunos autores han clasificado activadores de acuerdo con la ubicación de su objetivo de contacto en RNAP (por ejemplo, consulte [8])

Activadores que contactan con CTD

En muchos promotores dependientes del activador, la iniciación de la transcripción se suprime o se reduce de manera significativa mediante supresiones o sustituciones de un solo aminoácido en o CTD y, en muchos de estos casos, parece que el activador funciona al establecer un contacto directo con ocCTD (figura 1b). (revisado en [9], ver también [101]. El ejemplo más estudiado es la proteína receptora de AMP cíclico dimérica (CRP) (también conocida como proteína activadora del gen de catabolito [CAPl) en promotores diana donde el sitio de ADN para CRP se localiza aguas arriba de los elementos promotores. En el promotor /, por ejemplo, un parche expuesto a la superficie en la subunidad aguas abajo del dímero de CRP, activando la región 1, establece contacto directo con IxCTD, recluyéndolo al ADN del promotor [11-13]: este reclutamiento aumenta el total afinidad de RNAP para el promotor. Muchos otros activadores que se unen a sitios localizados aguas arriba de elementos promotores también funcionan al entrar en contacto con CTD: esto es posible porque los elementos de unión para c-CTD en promotores se encuentran localizados corriente arriba de la región -35 [9]. Curiosamente, existe una considerable variabilidad en la ubicación de los sitios de unión para los activadores que entran en contacto con CTD: esto se debe a que el CTD está conectado al resto de la subunidad O y, por lo tanto, al resto de RNAP mediante un enlazador flexible [14]. "]. Por lo tanto, los activadores situados en una variedad de posiciones aguas arriba pueden producir interacciones productivas con o CTD, siempre que la superficie activadora esté ubicada en la misma cara del ADN. Por lo tanto, el CRP puede activar la transcripción contactando CTD CT, proporcionando que está ligado cerca de la posición -61 con respecto al punto de inicio de la transcripción (como en el promotor / ac) o cerca de las posiciones -71, -81 o -91 [15,16].

Actualmente, se están investigando cuestiones clave relacionadas con el papel del CCDT en la activación de la transcripción. El primero se refiere a la superficie de o CTD que contactan los activadores: para investigar esto, se han examinado los efectos de diferentes sutituciones en o CTD (por ejemplo, ver [17, 18 *, 191)]. Estos estudios muestran que las sustituciones en la superficie de unión a ADN de O CTD pueden interrumpir la activación de la transcripción, probablemente porque la activación de la transcripción se previene si el CTD no puede acoplarse al ADN del promotor. La activación de la transcripción también se ve afectada por sustituciones en otras cadenas laterales que no están relacionadas con la unión al ADN, y los efectos de estas sustituciones varían de un promotor dependiente del activador a otro. Estas sustituciones muy probablemente identifiquen las superficies en o CTD que interactúan con diferentes activadores [9].

El segundo problema se refiere al papel preciso de las interacciones activadoras-CTD. ¿En qué pasos del proceso de iniciación se requieren estas interacciones? En el promotor lac, CRP es prescindible después de que se haya formado el complejo abierto [20]. Por lo tanto, el requisito para la interacción CRP-c ~ CTD se restringe a los pasos hasta e incluyendo la formación de complejos abiertos. ¿El papel de esta interacción es simplemente reclutar RNAP para el promotor, o son cambios de conformación inducidos por el activador, pasados ​​a través de c-CTD al resto de RNAP, también esenciales? Para investigar esto, RNAP se reconstituyó con subunidades O ~ en las que o ~ CTD se reemplazó por el dominio carboxi-terminal de la proteína cI del bacteriófago (que no está relacionada con o ~ CTD). El RNAP diseñado podría ser activado por la proteína cI de longitud completa en un promotor que contiene un sitio de unión para cI. Esto se demostró debido a interacciones directas entre las subunidades híbridas cc-cI en la RNAP modificada y la cI de longitud completa unida [21 "]. Por lo tanto, un contacto proteína-proteína arbitrario que recluta RNAP a un promotor puede ser suficiente para la activación de la transcripción. Esto argumenta que el reclutamiento es el principal mecanismo por el cual se activa la transcripción en lugar de los cambios de conformación inducidos por el activador transmitidos a través de c-CTD (al menos en los promotores estudiados).

ACTIVADORES QUE ENTRAN EN CONTACTO CON LA REGIÓN 4 de la subunidad RNAP G 70 Las funciones de algunos activadores se interrumpen por deleciones o sustituciones de un solo aminoácido en la región 4 de la subunidad RNAP G 70: en muchos de estos casos, parece que el activador funciona al hacer una contacto directo con cy 70 (Figura lc) (ver [22,23] para ejemplos). El ejemplo más estudiado es el bacteriófago) v cl proteína activadora que se une a un sitio objetivo que se superpone al elemento -35 en el ~. Promotor PR.II. Una región de activación cargada negativamente expuesta en la superficie en la subunidad corriente abajo del dímero cl hace contacto directo con la snbunit RNAP cy 70 [24 "]. El objetivo para este contacto se ha identificado como la región 4 de ~ 70, que incluye una hélice -turn-helix que se cree que entra en contacto con el elemento -35 en los promotores Algunas sustituciones de aminoácidos simples en la hélice-vuelta-hélice interfieren con la función cI [23], mientras que otros pueden compensar las sustituciones de control positivo en la región de activación de cI [25,26] Así, cI, y también varios otros activadores que se unen a sitios que se superponen a la región -35 en los promotores objetivo, funcionan al establecer contacto directo con un segmento de ~ 70 que se une al ADN en promotores independientes del activador. a la situación con activadores que contactan con c ~ CTD, los sitios de ADN para activadores que contactan con la región 4 de ~ 571) siempre se superponen a la región -35. Prcmadamente, esto se debe a que hay muy poca flexibilidad en la ubicación de la región 4 de cy 70 en promotores.

...