Análisis de la interacción de la proteína NSP del Virus Huasteco de la vena amarilla del chile (PHYVV) en su hospedador tomate

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 1][pic 2]

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA.

Análisis de la interacción de la proteína NSP del Virus Huasteco de la vena amarilla del chile (PHYVV) en su hospedador tomate.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN

RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

JOSHIO JOSUÉ MELÉNDREZ GRACIANO GUASAVE, SINALOA; MÉXICO ENERO DEL 2022

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 3]

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

CARTA CESIÓN DE DERECHOS

En la Ciudad de Guasave, Sinaloa el día 07 del mes 10 del año 2021, el que suscribe nombre Joshio Josué Meléndrez Graciano alumno del Programa de Maestría en Recursos Naturales y Medio Ambiente, con número de registro A200223, adscrito al CIIDIR Unidad Sinaloa, manifiesto que es el autor intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la dirección de los Drs. Jesús Méndez Lozano y Edgar Antonio Rodríguez Negrete, y cede los derechos del trabajo titulado “Análisis de la interacción de la proteína NSP del Virus Huasteco de la vena amarilla del chile (PHYVV) en su hospedador tomate”, al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con fines académicos y de investigación.

Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o directores del trabajo. Este puede ser obtenido escribiendo a las siguientes direcciones joshiomelendrez@gmail.com; jmendezl@ipn.mx y edgarrnegrete@gmail.com. Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.

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Joshio Josué Meléndrez Graciano

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El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de biotecnología agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). bajo la dirección del Dr. Jesús Méndez Lozano y el Dr. Edgar Antonio Rodríguez Negrete. El presente trabajo fue apoyado económicamente a través de los proyectos SIP 20201557 y 20211718 (IPN), beca CONACYT con clave CVU 907307 y el proyecto de desarrollo tecnológico e innovación para alumnos del IPN 2021.

DEDICATORIA

A mis padres, que me brindaron todo su apoyo durante esta importante etapa de mi vida, quienes siempre estuvieron atentos a cualquier cosa que necesitara.

A mi novia por estar conmigo animándome y escuchándome en los momentos difíciles cuando todo me salía mal.

A mis amigos y cada una de las personas que estuvieron durante los tiempos difíciles de la pandemia, haciendo que fueran más fácil de llevar.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Jesús, por acceder a conversar conmigo y posteriormente darme la oportunidad de unirme a su equipo de trabajo. El primer contacto mediante videollamada y probablemente el último de mi etapa como su alumno será de la misma manera, una vez más, todo termina como inicia.

Al Dr. Edgar, por ser un gran maestro, quien resolvió todas mis dudas y me enseñó a poder llevar a cabo cada una de las técnicas que necesité. Además, con quien pude platicar de deportes, cultura y de la vida en general, quién me escucho, apoyó y aconsejó en diversas ocasiones, fue un honor poder compartir este par de años con usted.

A mi comité tutorial, por apoyar tanto con sus críticas constructivas y ayudarme a tener un trabajo de mejor calidad.

A todos los miembros del laboratorio quienes estuvieron durante mi estancia, en especial a Lesly y Erika por tener con quienes platicar y reír durante largos turnos de trabajo, quienes siempre me apoyaron y me ayudaron a resolver mis dudas.

A mis compañeros de generación quienes a pesar de solo poder compartir dos meses de clases presenciales con mucha diversión y recuerdos divertidos (la caída de Ale), formamos un grupo sólido y nos reunimos cuando las condiciones lo permitían, gracias, amigos, sus palabras de apoyo y animo en cada presentación me ayudaban mucho.

A Leo y Julio, con quienes pase momentos muy divertidos y también de crecimiento al poder compartir diferentes puntos de vista.

Índice

1. Introducción        14
2. Antecedentes        16

1. Virus de plantas        16

1. Origen de los virus        17
2. Evolución y ecología de los virus vegetales        18
3. Familia Geminiviridae        19
4. Género Begomovirus        20

1. Emergencia de enfermedades causadas por begomovirus        21

1. El Virus huasteco de la vena amarilla del chile (PHYVV)        23

1. Sistema de doble hibrido de levadura (Y2H)        24

1. Estudios de interacción de la proteína NSP de geminivirus con distintos hospedadores        26

1. Silenciamiento génico inducido por virus (VIGS)        27

1. Justificación        31
2. Hipótesis        32
3. Objetivo general        32

1. Objetivos específicos        32

1. Materiales y Métodos        33

1. Cepas de microorganismos empleados y procedimientos básicos de biología molecular.        33

1. Especies vegetales, condiciones de germinación y crecimiento        33

1. Ensayos de interacción empleando la tecnología de doble híbrido (Y2H)        34

1. Generación de construcciones cebo derivados del gen NSP del virus PHYVV para escrutinio por doble híbrido (Y2H)        34
2. Verificación de genoteca de cDNA de tomate        34
3. Preparación de células competentes de levadura        35
4. Transformación de levadura        36

1. Sistema de doble híbrido (Y2H)        36

1. Escrutinio de interacción NSP-genoteca de tomate        37

1. Análisis de ácidos nucleicos        38

1. Extracción de DNA total        38
2. Extracción de RNA total y síntesis de DNA complementario (cDNA)        39
3. Extracción de DNA plasmídico bacteriano        40

1. Extracción de DNA plasmídico de Levaduras        40
2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)        41

1. PCR punto final        41
2. PCR cuantitativa (qPCR)        42

1. Diseño de cebadores específicos para la estrategia de inducción (VIGS) y cuantificación de silenciamiento de genes candidatos (RT-qPCR)        42
2. Generación de construcción para silenciamiento génico inducido por        43

virus (VIGS).        43

1. Transformación en la cepa GV3101 de A. tumefaciens con las construcciones en TRV        45

1. Evaluación biológica de interactores candidatos durante el proceso        45

infectivo de PHYVV en tomate        45

1. Resultados        47

1. Generación de construcciones BD y AD para el sistema Y2H.        47

1. Verificación de las construcciones NSP-Tam y NSP-Sin        48

1. Verificación de la genoteca de cDNA tomate        49
2. Validación del sistema de doble híbrido de levadura        50
3. Escrutinio de Y2H utilizando la NSP de Tamaulipas (BD) y una genoteca de cDNA de tomate (AD)        50

1. Funciones celulares relacionadas a las proteínas interactoras pertenecientes al escrutinio de la NSP de Tamaulipas.        52

1. Generación de construcciones en los vectores pGEM-T Easy y TRV de los genes codificantes de las posibles proteínas interactoras de la NSP de Tamaulipas.        57

1. Secuenciación de los fragmentos clonados en pGEM-T Easy.        58

1. Transformación del vector TRV con los genes de las posibles proteínas interactoras en la cepa GV3101 de A. tumefaciens.        59

1. Ensayo de silenciamiento con los genes de las posibles proteínas interactoras.        60

1. Ensayos de validación biológica        62

1. Validación biológica empleando el virus PHYVV-Tam        62
2. Validación biológica empleando el virus PHYVV-Sin        65

1. Discusión de resultados.        68
2. Conclusiones        73
3. Anexos        75

1. M Medios y soluciones        75

1. Referencias        78

Glosario

Amarillamiento: Fenotipo asociado a la destrucción de la clorofila de los tejidos verdes.

Célula: Son los bloques estructurales básicos de los seres vivos.

DNA: Nombre químico de la molécula que contiene la información genética en todos los seres vivos. La molécula de DNA consiste en dos cadenas que se enrollan entre ellas para formar una estructura de doble hélice. Cada cadena tiene una parte central formada por azúcares (desoxirribosa) y grupos fosfato. Enganchado a cada azúcar hay una de las siguientes 4 bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G), y timina (T).

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