BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS
daniepe28Informe16 de Noviembre de 2015
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BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS
a Bryan Alexander Escobar Victoria; 13220027
b Daniela Otero Epe; 13220034
a y b Universidad Icesi
Facultad de Ciencias Naturales, Programa de Química Farmacéutica
Laboratorio de Bioquímica
Santiago de Cali, Colombia
14 de Octubre de 2014
- INTRODUCCIÓN
Durante el metabolismo en un organismo vivo,se lleva a cabo un proceso energético denominado fosforilación oxidativa,el cual se da enpresencia de oxígeno al interior de las mitocondrias. Este proceso consisteen una serie de proteínas transmembranales que realizan un transporte de electrones (figura 1), generando un bombeode protones (H+) hacia el espacio intermembranal de la mitocondria o lado citosólico, de esta manera, se produce una fuerza protón-motriz que después es utilizada para la síntesis de ATP. Este bombeo de H+ genera un gradiente de carga y otro químico, el último está representado por el cambio en el pH. Durante esta práctica se comprobaraexperimentalmente la generaciónde ese gradiente de protones dentro de las mitocondrias de levaduras, por medio de la medición de pH, aprovechando que es 1.4 veces menor en el lado citosólico de la mitocondria que en la matriz. Además se van a evaluar los efectos de dos compuestos que causan una variabilidad en este proceso, estos son el 2,4-dinitrofenol (DNP) y la azida.
[pic 1]
Figura 1. Cadena de transporte de electrones. Disponible en: http://www.maph49.galeon.com/respcel/closer4a.html
- RESULTADOS
Para la elaboración de la práctica se requirió primeramente la preparación de 15mL de una solución al 20% de levadura. A partir de esta solución se prepararon 3 soluciones (figura 2) con diferentes cantidades de sustancias (ver tabla 1).
Tabla 1. Resultados de pH con adición de glucosa
Reactivo | Control | DNP | Azida |
Suspensión de levaduras al 20% | 5mL | 5 mL | 5 mL |
Agua destilada | 40 mL | 40 mL | 40 mL |
Solución de DNP 80 mM | -- | 0,2 mL | -- |
Solución de azida de sodio 800 mM | -- | -- | 0,5 mL |
En el vaso 1 se preparó la solución control que solo consistió en la solución de levadura con agua;en el vaso 2 se hizo lo mismo que en vaso 1 pero se agregó azida, y para el vaso 3 se adicionó DNP.
[pic 2][pic 3][pic 4]
Figura 2. Preparaciones a partir de la solución al 20% de levadura.
Después de ello se hizo uso de un pH-metro para realizardurante dos intervalos de tiempo un seguimiento al cambio de pH a cada una de estas preparaciones (ver tabla 2).
Tabla 2. Primeros resultados de pH
Tiempo | VASO | ||
1 Control | 2 DNP | 3 Azida | |
pH a los 0 minutos | 5,89 | 5,83 | 6,00 |
pH después de 5 minutos | 5,84 | 5,75 | 5,92 |
pH después de 10 minutos | 5,78 | 5,75 | 5,93 |
Para terminar, se tomaron las mismas soluciones anteriores y se adicionó una solución de glucosa al 10%, y después de agitar se empezó a hacer un seguimiento de pH cada 10 minutos durante 40 minutos (ver tabla 3).
Tabla 3. Resultados de pH con adición de glucosa al 10%
Tiempo después de la preparación | VASO | ||
1 Control | 2 DNP | 3 Azida | |
pH a los 5 minutos | 5,66 | 5,68 | 5,86 |
pH después de 10 minutos | 5,53 | 5,63 | 5,79 |
pH después de 20 minutos | 5,41 | 5,60 | 5,76 |
pH después de 30 minutos | 5,35 | 5,52 | 5,66 |
pH después de 40 minutos | 5,23 | 5,46 | 5,66 |
Por último, se realizó una gráfica donde se puede apreciar el cambio en el pH de cada una de las soluciones, así se puede hacer una comparación entre ellas, y concluir acerca de cada uno de sus efectos (ver grafica 1).
[pic 5]
Grafica 1. Comparación del cambio en pH en levaduras con glucosa al 10%, en presencia de un desacoplante (DNP) y un inhibidor (azida), a partir de una muestra control.
- ANÁLISIS DE RESULTADOS
Para el vaso 1 del control y el vaso 2 con DNP, se observó un bajón en el pH desde el inicio de la prueba, donde tuvieron un pH muy similar (5.66-5.68); a diferencia del vaso 3 con azida, en el cual el cambio de pH fue muy pequeño. Sin embargo, para el vaso 2, los resultados de pH no fueron tan bajos como en el vaso 1 del control. A pesar de esta diferencia de pH que se encontró al comparar con el vaso control, esta variación que se observó fue muy pequeña (ver Grafica 1).
El DNP (figura 3) tiene un pKa de 4.11 [1], por tanto se encuentra disociado a pH fisiológico (7.35-7.45), por lo cual al entrar a la mitocondria y encontrarse en medio de un pH mucho más acido, por el gradiente de protones generado durante el transporte de electrones, este se protona. El DNP protonado se vuelve permeable a la membrana interna de la mitocondria, lo cual facilita la entrada de protones hacia la matriz sin que estos lleguen a generar la fuerza protón-motriz necesaria para sintetizar ATP. [pic 6]
[pic 7]
Figura 3. Estructura del 2,4-dinitrofenol (DNP). Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/2,4-dinitrofenol
Por esta razón, se concluye que la función de este compuesto es impulsar al desacoplamiento entre la cadena transportadora de electrones en la fosforilación oxidativa, es decirque el DNP no es un inhibidor de la cadena transportadora de electrones, sino más bien un agente desacoplante del proceso de esta cadena con el de la ATP sintetasa (Figura 4), al igual que otros compuestos ácidos aromáticos[2].
[pic 8]
Figura 4. ATP sintetasa o Complejo V de la cadena de electrones. Disponible en: http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/10energia.htm
Por otro lado, si se hace un análisis del pH en la solución que tenía azida, es decir, el vaso 3, es notable que el cambio de pH es casi despreciable, esto se debe a que la azida funciona como un inhibidor de la cadena transportadora de electrones y no como un agente desacoplante como lo es el DNP.
La azida funciona impidiendo el flujo de protones por la citocromo c oxidasa o complejo IV (figura 5), deteniendo el proceso del transporte de electrones. El complejo IV está formado por varios grupos prostéticos: dos de ellos son grupos hemo, es decir, tienen un centro de hierro (Fe), denominados a y a3; y otros dos tienen un centro de cobre (Cu), llamados CuAy CuB[3]. Este complejo recibe 4 electrones que reducen los citocromos a3 y CuB, que forman un centro binuclear en donde se reduce el oxígeno molecular (O2) a agua; además estos 4 electrones permiten el paso de 4 H+ al espacio intermembranal de la mitocondria.
[pic 9]
Figura 5. Estructura del complejo IV o la citocromo c oxidasa . Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Fosforilaci%C3%B3n_oxidativa
Entonces, el ion azida (figura 6) reacciona con la forma ferrica (Fe3+) del citocromo a3 [2], al reducirlo debido a su gran carga de electrones, evita que se puedan recibir los 4 electrones, por tanto, impideel bombeo de protones que generaría un mayorgradientede concentración de H+al lado citosólico de la mitocondria, por esto el pH ya no va a disminuir en gran mesura, esto se confirma con los resultados, donde se observa un mayor pH en la solución del vaso 3 con azida (Gráfica 1).
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