Bioquimica: Cuantificación De Proteínas Por El método Lowry

INFORME DE LA PRÁCTICA Nº 20: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY

OBJETIVO:

El objetivo de esta práctica es determinar la concentración de proteínas de una muestra, a través del método de Lowry, utilizando el Folín-Ciocalteau que es reducido por los complejos de coordinación que forman las proteínas con el cobre a través de enlaces peptídicos, que da una coloración azul, que puede ser cuantificada espectofotométricamente siendo proporcional a la concentración de proteínas.

MATERIAL EMPLEADO:

-Agua destilada

-Seroalbúmina (SAB)*

-Micropipetas (dos en las cuales emplearemos puntas amarillas y una con punta azul)

-Tubos de hidrólisis

-Espectómetro

-Gradilla con los tubos de hidrólisis

-Pipeta Pasteur

*SAB: es una proteína que mezclada con una cantidad conocida de Folín A-C, será empleada para obtener los valores que se usarán a la hora de realizar una recta patrón.

REACTIVOS EMPLEADOS:

Folín A-C: Utilizado para elaborar los cinco tubos de hidrólisis, los cuales darán lugar a la recta patrón y facilitarán la función del Folín-Ciocalteau. El Folín está compuesto por:

CuSO4 que proporciona el Cu para formar el complejo con las proteínas.

NaOH y Na2 CO3 que proporcionan el medio alcalino adecuado para la reducción del Folin-Ciocalteau.

Tartrato sódico – potásico que impide la precipitación del Cu metálico en disolución.

Folín-Ciocalteau: El cual contiene Fosfomolibdeno y fosfowolframio que serán reducidos por el complejo cobre – proteína formado en medio alcalino, con la aparición del color azul intenso característica de esta reacción. Este así mismo, contribuirá a la formación de complejos de coordinación.

*IMPORTANTE: Previo a empezar con los cálculos y el procedimiento experimental, es necesario limpiar y rotular nuevamente todos los tubos.

PROCESO EXPERIMENTAL:

-El primer paso que hay que realizar es el de preparar los tubos con las muestras.

-Ahora, por un lado preparamos los tubos correspondientes al patrón de SAB:

BLANCO: 0.4 m. de H2O (destilada)

PATRÓN 1: 0.3 ml.de H2O (dest) +0.1 ml. de SAB

PATRÓN 2: 0.2 ml deH2O (dest)+0.2 ml de SAB

PATRÓN 3: 0.1 ml de H2O (dest.)+0.3 ml SAB

PATRÓN 4: 0.4 ml de SAB

-Y por el otro lado preparamos las diluciones:

DILUCIÓN CONTENIDO

1:5 200 μL muestra + 800 μL H2O

1:10 100 μL muestra + 900 μL H2O

1:25 40 μL muestra + 960 μL H2O

-Ahora que ya tenemos realizadas las diluciones, pasamos a preparar cada una en un tubo de hidrólisis:

·En el tubo de la dilución 1:5 se echan 200 μL de muestra y 800 μL de H2O.

·En el tubo de la dilución 1:10 se echan 100 μL de muestra y se completa con 900 μL de H2O.

·En el tubo de la dilución 1:25 se echan 40 μL de muestra y se completa con 960 μL de H2O.

-Una vez preparadas las diluciones, pasamos a preparar otra batería de tubos, en este caso 6, correspondiendo dos tubos a cada dilución, de forma que:

·En los dos tubos correspondientes a la dilución 1:5 echamos 400 μL de esta en cada uno.

·En los que corresponden a la dilución 1:10 echamos otros 400 μL de esta en cada uno.

·En los que corresponden a la dilución 1:25 echamos 400 μL de esta en cada uno.

-Ahora, por otra parte tenemos otra batería de nueve tubos, del cual uno será el BLANCO (400 μL de agua) y en los otros ocho, de los cuales corresponden una pareja de ellos a cada patrón, siendo esta la forma y las medidas que tomamos:

·En la pareja que corresponde al patrón 1 se echan 300 μL de

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