Bioquimica experimental

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP

Departamento de Química

Prática 3: Eletroforese

Nayara do Nascimento Rodrigues

Thaís Ap. Santos Oliveira

Turma 1 – Grupo 12

Bioquímica Experimental

Profº Pietro Ciancaglini

Ribeirão Preto

Março de 2014

1. Procedimento experimental

O procedimento experimental foi realizado de maneira integralmente demonstrativa. De início, foi feita a montagem da cuba para a eletroforese, onde vedou-se as laterais e a parte inferior da mesma com silicone, de maneira a ficar bem pressionado, para que posteriormente não houvesse vazamento do gel de corrida, que foi preparado e logo colocado lá dentro, de modo a ocorrer a polimerização do composto. A figura 1 apresenta o esquema de preparo do sistema utilizado na eletroforese.

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Figura 1: Esquema da preparação do sistema. Fonte: http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=246&ordem=2

A preparação dos géis foi feita em seguida à montagem. Primeiramente preparou-se o gel de corrida (running), e o mesmo foi colocado na parte inferior do sistema, contando com a ausência de oxigênio, para que a polimerização ocorresse de maneira uniforme. O ponto que indicou o fim da polimerização do gel de corrida foi observado a partir do momento em que não houve mais movimentação desse composto dentro do sistema quando mobilizado. Em seguida, foi preparado o gel de concentração (stacking) e o mesmo só foi adicionado na parte superior da cuba após completa polimerização do gel de corrida, para que não houvesse a mistura dos dois, como pode ser observado na figura 1. Os mesmos foram feitos a partir da polimerização da Acrilamida, da qual a reação foi catalisada com persulfato de amônio, conforme a reação mostrada na figura 2. O sistema foi montado em condições desnaturantes seguindo o procedimento do protocolo e as quantidades de reagentes utilizados são apresentadas na figura 3.

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Figura 2: Polimerização da Poliacrilamida catalisada por persulfato de amônio e a estrutura química do gel pronto. Fonte: http://www.infoescola.com/wp-content/uploads/2011/07/eletroforese1.jpg

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Figura 3: Tabela presente no protocolo experimental contendo as quantidades de reagentes utilizados para a preparação dos géis Stacking e Running.

Assim que o gel de stacking foi adicionado na cuba, logo em seguida fixou-se o pente no suporte de eletroforese para que os poços (regiões onde são colocadas as amostras) fossem devidamente formados. Seguidamente a polimerização total do stacking gel, o pente foi retirado da cuba e aplicou-se, nos poços de gel, as amostras de proteínas devidamente preparadas em condições desnaturantes (presença de SDS e βmercaptoetanol). Feito isso, aplicou-se uma baixa potencia para realizar o stacking, ou seja, a concentração das amostras na “linha de largada” e, após isto, aumentou-se a corrente para 197 V (figura 4) e iniciou-se o processo de running.

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Figura 4: (a) foto do aparelho marcando a voltagem da corrente elétrica durante o running e (b) foto do sistema em funcionamento.

1. Realização da eletroforese

Ambos os géis, de corrida (running) e de concentração (stacking), foram feitos com acrilamida, pois este composto forma géis de alta resolução e estáveis numa ampla faixa de pH (3,5-10), por isso são utilizados quando necessita-se analisar moléculas relativamente pequenas. A vantagem da acrilamida está na possibilidade de controlar o tamanho dos poros, que é feito de acordo com a variação da concentração deste reagente.

O pH empregado na eletroforese em condições desnaturantes, tem a função de fornecer íons para que ocorra a condução das soluções. Sendo assim, o pH no stacking gel deve ser menor do que o pH do gel de corrida para que se obtenha uma força iônica menor e, dessa maneira, as moléculas se concentram logo no começo do gel de corrida, sem que o sobressaia antes do início da eletroforese. Pelo mesmo motivo utilizou-se uma corrente inferior, por isso, ao ser polimerizado o gel stacking, objetivou-se obter poros maiores, quando comparados ao gel de corrida.  Isto para que na fase de concentração das amostras não necessitasse de uma corrente elétrica igual ou superior à corrente utilizada na fase de corrida e assim, as amostras não invadissem o gel de corrida. Em outras palavras, aplicou-se no stacking gel (menos denso, pois possui poros maiores) uma corrente inferior à utilizada no gel de corrida (mais denso, pois contém poros mais estreitos), o que permitiu o bloqueio das moléculas logo na linha de separação entre as duas fases, formando assim a linha de largada ou região do front.

Adicionou-se azul de bromofenol como reagente de corrida, uma vez que sua coloração azul permite visualizar onde está o início e o termino do experimento, uma pois este composto é relativamente pequeno e possui coloração azul quando comparado as proteínas analisadas, que são incolores e de tamanhos maiores.

Após o término da eletroforese, banhou-se todo o gel de corrida com solução de azul de bromofenol para que as bandas das amostras pudessem ser reveladas. Depois repousar o gel durante 30 minutos nessa solução, o mesmo foi retirado e colocado em uma solução descolorante (mistura de etanol e ácido acético) para limpar a cor azul contraída no gel e, assim, revelar apenas as bandas deixadas pelas amostras protéicas como mostra a figura 5.

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