CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Autores (Cano & Castro)

Estudiantes de la asignatura Bioquímica

RESUMEN

En el laboratorio se utilizaron las técnicas de filtración y fotocolorimetría para separar y definir la concentración de las proteínas del lactosuero. Lo cual consistió en llenar 5 tubos marcados previamente, con diferentes concentraciones de proteínas y reactivo de Biuret, estos se dejaron reposar durante 15 minutos y posteriormente se le leyó la absorbancia a cada tubo con una longitud de onda de 540 nm.

Palabras clave: Proteínas, Lactoglobulinas, Lactoalbúminas, Filtración, Fotocolorimetría.

1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son moléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. Estas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que se destacan; estructural, inmunológica, enzimática, contráctil, homeostática, transducción de señales, protectora o defensiva.

Por sus propiedades físico-químicas, las proteínas pueden ser clasificadas en proteínas simples (holoproteidos), formadas solo por aminoácidos o sus derivados, proteínas conjugadas (heteroproteidos), formadas por aminoácidos acompañados de sustancias diversas, y proteínas derivadas, las cuales son sustancias formadas por desnaturalización y desdoblamiento de las anteriores.

Las principales propiedades que permiten la existencia y aseguran la función de las proteínas son:

Estabilidad: la proteína debe ser estable en el medio donde desempeñe su función. Para ello, la mayoría de proteínas acuosas crean un núcleo hidrofóbico empaquetado. Está relacionado con su vida media y el recambio proteico.

Solubilidad: es necesario solvatar la proteína, lo cual se consigue exponiendo residuos de similar grado de polaridad al medio en la superficie proteica. (Mejía, Moncayo , & Chavez, 2015)

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Separar en una muestra de lactosuero, las globulinas y albúminas, de las proteínas totales.

2.2 Objetivos específicos

Calculas la concentración de proteínas totales.

Calculas la concentración de lactoglobulinas.

Calculas la concentración de lactoalbúminas.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Para preparar extractos proteínicos a partir del medio celular se han desarrollado técnicas basadas en las diferencias que presentan las proteínas en cuanto a tamaño, carga, masa, solubilidad y afinidad por otras moléculas. Estas técnicas son: la centrifugación, la electroforesis, la cromatografía, la diálisis, ultra fijación y diferencias en la solubilidad en diferentes medios.

1. Materiales y reactivos

• Fotocolorímetro
• Celdas de fotocolorímetro
• Tubos de ensayo grandes
• Gradillas
• Micro pipeta de 100 a 1000  uL
• Embudo de vidrio
• Soporte universal
• Aro metálico
• Lienzo
• Papel de filtro
• Probeta de 50 mL
• Beakers de 250 mL y 100 mL
• Frasco lavador
• Solución acuosa de NaCl al 0.9%
• Solución saturada de (NH4)2SO4 (750 gr en 1 L de agua)
• Sulfato de amonio sólido
• Solución patrón de gelatina (0.15 gr en 100 mL de solución salina)
• Solución de Biuret
• Muestra de lactosuero

1. Procedimiento experimental

A. Preparación del lactosuero.

Extraer 30 ml de zumo de limón         En un beaker de 250 ml, vaciar 200 ml de leche entera y adicionarle el zumo de limón         Dejar reposar 15 minutos a temperatura ambiente, posteriormente llevarlo a la nevera por 60 minutos         Separar el lactosuero por filtración al vacío.[pic 1][pic 2][pic 3]

B. Tratamiento del lactosuero para extraer proteínas

Filtrar por un lienzo 40 ml de lactosuero en una probeta de 50 ml         Separar 5 ml para la preparación de las proteínas totales del lactosuero         Llevar 35 ml del filtrado a un beaker de 250 ml y añadir 35 mL de solución de sulfato de amonio saturado y agitar suavemente, dejar reposar por 10 minutos         Filtrar el precipitado con papel de filtro convencional (usar dos unidades de papel para optimizar los tiempos), el cual contiene las lactoglobulinas y el filtrado las lactoalbúminas         Disolver el precipitado de cada papel de filtro en un beaker de 100 ml, añadiendo una porción de 15 ml de cloruro de sodio al 0,9% (solución de lactoglobulina). Conserve esta solución para determinar el porcentaje de lactoglobulinas. Agregar al filtrado suficiente (7gramos) sulfato de amonio sólido, para saturar la solución, agitar suavemente y dejar reposar 10 minutos. Se precipitan las lactoalbúminas       ------ Filtrar rápidamente el precipitado anterior (lactoalbúminas) por papel filtro convencional y disolver el precipitado en beaker de 100 ml con 30 ml de cloruro de sodio al 0,9%.[pic 4][pic 5][pic 6][pic 7][pic 8]

C. Preparación de la solución de proteínas totales del lactosuero.

Mida 1 mL del lactosuero en una probeta y dilúyalo hasta completar 20 mL agregándole solución salina.

D. Medición de la absorbancia en las soluciones que contienen proteínas.

Disponga de 4 o 5 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones          Agite cada tubo y déjelo reposar 15 minutos          Lleve cada uno de los tubos al fotocolorímetro, fijado en una longitud de onda de 540 nm. Luego de una previa calibración con el blanco, anote los resultados de absorbancia registrados en el instrumento.[pic 9][pic 10]

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