Citómetro de flujo - Inmunologia

..Diapositivas:

Diapo 1: Presentacion

Buenas tardes, compañeros, profesor, mi nombre es y junto a mis compañeros de grupo(nombres), expondremos sobre la citometria de flujo, que es una técnica de análisis celular. Mi nombre

Diapo 2: Objetivos

Dentro de nuestros objetivos en esta exposición tenemos:

Conocer que es la citometria de flujo, dando a conocer en que consiste y como ha ido evolucionando está a través de la historia, también conoceremos cuál es su funcionamiento y como está compuesta estructuralmente esta técnica celular ya que posee muchas estructuras importantes para la perfecta realización de la técnica, y daremos a conocer las ventajas y desventajas que posee esta, y por ultimo tenemos un ejemplo de su uso a nivel clínico, el cual nos dará una idea de cómo la podremos utilizar nosotros dentro de nuestra carrera.

Diapo 3: Introducción

Como sabemos la ciencia a través del tiempo siempre ha buscado técnicas que le ayuden en la optimización del trabajo complementado con conseguir un resultado más exacto, sabiendo que la celula es la unidad funcional de todo ser vivo, pero esta es muy pequeña y estudiarla una por una lleva demasiado tiempo, es por esto que a lo largo de la historia surgio la necesidad de conocer las células, tamaño, componentes y relaciones con otros tipos de celula en este caso antígeno anticuerpo, esto se logró a través de la citometria de flujo. que es una técnica celular que consiste en medir características de las células a través de fluorescencia y dispersión de luz que poseen, esta información es llevada a distintos aparatos que miden estas reacciones que provoca la células al pasar por el haz de luz, estos fue utilizada por primera vez en 1953 por Wallace H. Coulter basándose en el  principio Coulter que hace referencia al uso de un campo eléctrico para contar y dimensionar partículas que se encuentran en suspensión en un líquido conductor, esto fue utilizado en hemtaologia,

Luego, en 1953, Crosland y Taylor inventaron una cámara de flujo basada en la inyección de la muestra en el seno de un fluido de arrastre a través de un capilar que se estrecha y centra el flujo de la muestra.

También en 1953, Parker y Horst idean el primer contador diferencial hematológico, el cual permitía distinguir eritrocitos de leucocitos. Así se introduce la luz por primera vez como parámetro medible por Citometría de Flujo. Más adelante, en 1965, Katmentsky introdujo avances como el uso de espectrofotometría para cuantificar ADN. Utilizo la medida multiparamétrica de la luz dispersada para evaluar características nucleares y el empleo de sustancias fluorescentes que permiten mayor discriminación de la señal que los colorantes de absorción.

En 1965 Mack Fulwyler desarrolló el microfluorometro de flujo de los alamos que se convirtió en el precursor de los instrumentos de hoy. En particular, él era responsable de crear un separador electrónico basado en el volumen de la célula. Este instrumento podría separar las células basándose en el volumen de las células electrónicas y también utilizar la deflexión electrostática para la segregación y la clasificación.

El primer dispositivo de citometría de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por Wolfgang Göhde de la Universidad de Münster, comercializado por primera vez en los años 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec encargada del desarrollo y producción a través de Phywe AG en Gotinga. En aquel tiempo los métodos de absorción electromagnética tenían el favor de la comunidad científica sobre los métodos fluorescentes.3​ Poco tiempo después comenzó el desarrollo comercial de los citómetros de flujo

Uno de los grandes avances posteriores a su creación fue en 1977 en donde Herzenberg diseñó un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS).

Diapo 4: Fundamento

- ¿QUE ES? La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico

- ¿Para qué se utiliza? empleada en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas, presencia de biomarcadores, y en la ingeniería de proteínas

Diapo 5: Fundamento

-Funcionamiento: cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula

- ES NECESARIO POSEER: suspensión celular que corresponde a la muestra y el citómetro de flujo.

Diapo 6: Citómetro de flujo

Los citómetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de partículas por segundo, en tiempo real, y pueden separar y aislar activamente partículas de acuerdo a propiedades específicas. Un citómetro de flujo es en cierta forma similar a un microscopio, salvo que, en vez de producir imágenes de las células, los citómetros de flujo ofrecen una cuantificación automática de una serie de parámetros con altísima calidad

Diapo 7: Estructura básica

Formados por 3 sistemas:

• Un sistema de flujo o hidrico: contiene la suspensión celular,que permite un enfoque hidrodinámico del flujo hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células, donde en los separadores celulares, se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células individuales.
• Un sistema óptico: consiste la óptica de excitación que es en un láser y los lentes de enfoque, y la óptica de lectura cnformada por dos detectores lumínicos denominados Forward Scatter y SideScatter recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas,los detectores fluorescentes y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.
• Un sistema electrónico: se encarga de recibir y procesar los datos y representar lo resultados de este graficamente

Diapo 8: Explicación de la técnica

-Proceso: La suspensión celular se prepara en la fase denominada pre-citometría. Esta suspensión se compone de las células a estudiar más anticuerpos monoclonales marcados con reactivos fluorescentes. Estos marcadores pueden ser de unión covalente y no covalente o moléculas orgánicas y proteínas fluorescentes que se utilizan según el protocolo del estudio.

Estos anticuerpos han sido diseñados para unirse a diferentes antígenos específicos. En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida.

Una vez preparada la suspensión celular, se inyecta al sistema de flujo, por donde las células pasarán una a una y serán atravesadas por el rayo láser

Diapo 9 y 10: Dispersion de la luz hacia FS y SS

Esto provocará que la luz se disperse hacia adelante al detector lumínico Forward Scatter, que provee la información acerca del tamaño de la célula. También se provocará que la luz se disperse lateralmente hacia el detector lumínico SideScatter, proporcionando información de la complejidad celular, es decir, la granulación y morfología.

Diapo 11y 12: Las células emiten fluorescencia

Las células en las que se hayan producido el complejo antígeno-anticuerpo emiten la fluorescencia que es captada por detectores fluorescente lo que permite la detección del tipo celular

Diapo 13: Procesamiento de datos

Finalmente, las células son dirigidas a distintos túbulos colectores que clasifican las poblaciones celulares de acuerdo a los parámetros medidos, estos datos serán procesados y graficados por el software del citómetro

Diferentes fluorocromos detectados- complejidad de su citoplasma- tamaño de la célula

Debido a pequeñas variaciones en la célula, un mismo fluorocromo puede ser representado en nuestros datos como intensidades ligeramente diferentes, pero siempre manteniendo en esencia el mismo color

Diapo 15: Info obtenida por citómetro

• Tamaño celular
• complejidad interna
• intensidades relativas de emisión de fluorescencia

Diapo 16: Análisis de datos

Dependiendo del número de parámetros a comparar, se pueden realizar distintos tipos de representación

Diapo 17: Histograma

- Histograma: Representa la presencia de un único parámetro.

Ejemplo 1: la longitud de onda de un fluorocromo. En el eje de abscisas(X) muestra las diferentes intensidades mientras que en el eje de ordenadas(Y) contabiliza el número de células que emitieron luz de esa intensidad y color. A partir de una intensidad concreta, se considera resultado positivo para ese fluorocromo.  

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