Cromatografía en columna.

 
“CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA”

RESUMEN

La cromatografía es un método de separación de muestras, existen varios tipos y uno de ellos es la cromatografía en columna. En este método, la fase móvil y el eluyente son el mismo, se lleva a cabo en una columna empaquetada con la fase estacionaria al fondo. La sustancia que se pretende separar se eluye probando mezcla de disolventes, comenzando con el menos polar.

Dependiendo de la polaridad del disolvente y las interacciones que tenga con el soluto, éste último se separa en distintas fracciones. Cada una de las fracciones debe ser inoculada en una cromatografía de capa fina para verificar su pureza.

OBJETIVO

• Conocer los fundamentos y la aplicación de esta técnica en la purificación de compuestos.

INTRODUCCIÓN

La cromatografía en columna es una variedad de la cromatografía en la cual la fase móvil, que es un líquido pasa a través de una fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida, en un recipiente cilíndrico. La fase móvil pasa a través de la fase estacionaria por efecto de la gravedad a lo largo de una columna recta y es recogida del eluido en fracciones.

El término cromatografía líquida (debido a la fase móvil), se usa para referirse a los métodos en los cuales la separación se produce dentro de una columna empaquetada. El material de empaque es la fase estacionaria y puede tratarse de un sólido con capacidades adsortivas. Se usa una fase móvil líquida como eluyente. Lo que diferencia este tipo de cromatografía de la cromatografía en capa fina y en papel, es que las separaciones tienen lugar en una columna en lugar de una superficie plana. (Alfonso, 2000)

La cromatografía en columna tiene varios inconvenientes a la hora de llevarla a la práctica, pues es lenta, poco eficaz tanto en la capacidad de discriminación entre solutos como en el número de solutos que pueden separarse y no proporciona directamente el cromatograma de la muestra. (Valcárcel & Gómez, 1988)

Para que una cromatografía de este tipo sea eficiente, se debe trabajar a elevadas presiones en lugar de utilizar sólo la fuerza de la gravedad, para hacer que la fase móvil pase a través de la fase estacionaria, esto reduce el tiempo que lleva eluir la muestra y se aumenta la eficacia separativa.

Según la naturaleza de la fase estacionaria, existen diferentes tipos de cromatografía en columna, por ejemplo:

1. Sólido activo: cromatografía de adsorción y cambio iónico
2. Sólido inerte de porosidad controlada: cromatografía de exclusión
3. Líquido retenido por un sólido poroso inerte: cromatografía de partición

Una cromatografía en columna, se monta como muestra la figura 1. El tubo se rellena con un sólido adsorbente, que actúa como fase estacionaria. Los adsorbentes sólidos más utilizados son: el gel de sílice, alúmina y el silicato de magnesio. El tamaño de la partícula varía entre 50 y 120 µm, por lo cual la superficie de adsorción es grande. Es importante el tamaño de las partículas porque determina la resistencia de la columna empaquetada al flujo del solvente.

[pic 1]

Figura 1. Montaje de la columna para la cromatografía.

La polaridad de un compuesto hace que se fije al adsorbente, cuanto mayor es su polaridad, se fijan con más fuerza a la superficie adsorbente. La eficacia de retención del adsorbente puede modificarse añadiendo agua y se mide por la rapidez de elución de un colorante.

Además de los modos de desarrollo del cromatograma, se deben tener en cuenta la naturaleza del adsorbente y la composición de la fase móvil. La tendencia de una especie a ser adsorbida se puede modificar eligiendo adsorbentes y disolventes de distinta polaridad.

Un adsorbente es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes líquidas o gaseosas. Los adsorbentes se pueden clasificar en función de la intensidad con que adsorben cierta especie y de su capacidad de adsorción (ver figura 2).

Los disolventes se pueden ordenar de acuerdo a su capacidad de elución. El orden varía con la naturaleza del adsorbente y de la sustancia a eluir, pero en general, se determina por las constantes dieléctricas de cada disolvente. Así, para un adsorbente muy fuerte, la capacidad del eluyente disminuye (Pickering, 1980).

[pic 2]

Figura 2. Adsorbentes usados en la cromatografía en columna,
se presentan en función de su capacidad de adsorción

El tamaño de la columna para la cromatografía está determinado por la cantidad de mezcla a separar, la velocidad a la cual el disolvente fluye a lo largo dela columna se denomina velocidad de elusión y es importante en la efectividad de la separación. El tiempo que la mezcla a separar permanece en la columna es directamente proporcional a la magnitud del equilibrio entre las fases estacionaria y móvil (Lamarque & Maestri, 2008).

En la cromatografía en columna, se utilizan sucesivamente distintos disolventes, cada uno más enérgico que el anterior. Este procedimiento, permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas. Cuando se usan adsorbentes en la columna, el principal proceso responsable de la separación es a adsorción selectiva. Para poder obtener zonas de elución sin distorsión es necesario:

• No sobrecargar la columna de solutos
• Los efectos de difusión deben ser despreciables
• La adsorción y la desorción del soluto sobre la fase estacionaria debe ser casi instantánea
• La distribución del soluto entre las dos fases debe variar linealmente con la concentración

Las ventajas que presenta este método cromatográfico sobre la cromatografía en capa fina (véase reporte “Cromatografía en capa fina”) son:

1. Permite inocular y separar mayor cantidad de muestra.
2. Los cabios secuenciales de la polaridad del disolvente mejora la eficiencia de la separación.
3. Hay un desplazamiento ilimitado del frente del disolvente.

METODOLOGÍA

Parte A. Preparación del tapón de la base

Se montaron 2 columnas, una a micro escala, utilizando una pipeta pasteur y otra a macro escala utilizando una bureta. Para tapar el fondo de alguno de los materiales antes mencionados, se utilizó un tapón de algodón, esto para evitar que la sílica salga de la columna.

Al algodón se le agregó hexano, este algodón no debe compactarse, pues esto impediría el paso de cada uno de los disolventes.

 Parte B. Adición del adsorbente

La fase estacionaria de la columna fue la sílica. Para adicionarla se añadió disolvente, en este caso hexano, a la pipeta y bureta, en seguida se añade el adsorbente seco. Para que la muestra sea homogénea y evitar que se formen burbujas, se golpean suavemente las paredes cada que se agrega adsorbente.

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