DEGRADACION DE SACAROSA A PARTIR DE LA BACTERIA LEUCONOSTOC MESENTEROIDE OBTENIDA DEL ZUMO DE CAÑA DE AZUCAR

DEGRADACION DE SACAROSA A PARTIR DE LA BACTERIA LEUCONOSTOC MESENTEROIDE OBTENIDA DEL ZUMO DE CAÑA DE AZUCAR

Karen Johana Micán Garcia1, Maria Fernanda Hernandez Suarez2

RESUMEN.

Las características físicas y químicas del zumo de caña de azúcar hacen que este sea un sustrato adecuado para el desarrollo de microorganismos; La más común es Leuconostoc mesenteroides, esta bacteria degrada la sacarosa presente en el jugo de caña e incorpora acido láctico y forma el polisacárido como dextrana. Se tomo la muestra de un ingenio azucarero del valle del cauca los cuales fueron sembrados un medio liquido de 20ml del zumo de caña de azúcar, glucosa al 0,1%, peptona al 1,0% con sales mínimas esenciales e incubado a 25°C durante 8 días. Se aísla por el medio agar nutritivo por siembra en rejilla y purifica la bacteria por medio mayeux por estría antes de realizar las diferentes pruebas de identificación; teniendo en cuenta como fuente de carbono la sacarosa (sustrato) y glucosa en cantidad mínima y como fuente de nitrógeno la peptona; se caracteriza morfológicamente por medio de la tinción de Gram; siendo Gram positivo de forma cocobacilo, agrupadas en pares o cadenas además de realizar caracterización por medio de pruebas bioquímicas específicas.

Palabras clave: Leuconostoc mesenteroides, aislamiento, purificación

INTRODUCCIÓN.

El azúcar producido por la caña de azúcar deteriorada no reúne las condiciones aceptables para su uso en la elaboración de algunos alimentos debido a la perdida de sacarosa y la formación de dextrana; esto se debe a las características físicas y químicas del jugo de caña de azúcar hacen de este un excelente sustrato para el desarrollo de algunos microrganismos siendo uno de estos Leuconostoc mesenteroides, el cual degrada la sacarosa presente además de formar e incorporar metabolitos como el ácido láctico, etanol y polisacáridos como dextranas.

En el jugo de caña de azúcar se pueden encontrar bacterias productoras de ácido láctico a partir de la fermentación de la sacarosa, dentro de este grupo los géneros más comunes son: Leuconostoc, Lactobacillus y Pediococcus. Estas bacterias pueden encontrarse en el clarificador donde cae la melaza o puede venir directamente en el jugo de caña después de la molienda, siendo este último el más propicio para el crecimiento de las bacterias anteriormente mencionadas. (Reyes, Garcia, Torres, Hernandez, & Maldonado, 2018).

Dado que la temperatura no afecta significativamente el consumo de azúcares de estos grupos microbianos también son los causantes de las mayores pérdidas de eficiencia en la fermentación, debido a la producción de ácidos orgánicos como ácido láctico y acético. (Centro de Investigación de la Caña de Azúcar, Cenicaña., 2019)

La bacteria Leuconostoc mesenteroides durante su metabolismo es la responsable de una disminución significativa de la producción de azúcar debido a los procesos de fermentación, presentándose perdidas alrededor del 20% del total producido; ocasionando la dextrana que se caracteriza por ser gomoso y generar olores en el área de molienda  (Raimbault, 1994)

MATERIALES Y METODOS.

Recuperación de microorganismos:

El propósito de la recuperación es que a partir del caldo en el que se quiere sembrar la muestra, el organismo a evaluar pueda crecer aumentando el número de su población para un posterior aislamiento, para ello tomamos 20 ml del zumo de caña de azúcar, obtenida de un cultivo de caña, con una pipeta estéril de 10 mL y se sirve en un Erlenmeyer de 250 mL, en este hay 80 mL al que se le ha adicionado glucosa al 0,1 % como fuente de carbono, como fuente de nitrógeno la peptona al 1,0 %, y sales mínimas esenciales, se dispone a agitación circular, y se procede a incubar el Erlenmeyer a 25° C durante 8 días, con un pH 6.7.

Después del tiempo de incubación se realiza una dilución de la muestra con el objetivo de reducir la concentración de organismos, para ellos tenemos los siguientes pasos: primero se debe homogenizar la muestra en el Erlenmeyer por un minuto y se toman 10 ml de esta y se agrega a un frasco de 90 ml de agua peptona para dilución, aquí obtendríamos la dilución 10-1 (10 células por milito), se debe agitar por mínimo 5 minutos de esta mezcla se realizan tres diluciones de 9 ml cada una con agua de peptonada de dilución, para ello se extrae 1 ml para la primera dilución que contendría 10-2 células/mililitro, se agita hasta homogenizar, y se procede a sacar 1 ml de la obtenida para realizar una nueva dilución quedando 10-3 células/mililitro, nuevamente mezclamos y procedemos a extraer 1 ml de la muestra obtenida y se lo adicionamos a la tercera dilución, al haber realizado las 3 diluciones se procede a escoger esta última para aislamiento mediante  siembro en caja Petri. (Lab, 2015)

Aislamiento de microorganismos

El objetivo es evaluar las colonias y las diferentes morfologías de colonias que existan, dispersando en la superficie del agar, el número de células que hay, distantes una de otra; es decir que a partir de la siembra por rejilla en el medio de cultivo seleccionado se podrá tener crecimiento de cepas separadas, para ello se toma el caldo incubado anteriormente, se agita para mezclarlo y se procede a sembrar en caja Petri con medio de cultivo  agar nutritivo, es un medio de cultivo usado para todo tipo de bacterias, permanece solido incluso a altas temperaturas y el crecimiento en este se hace en la superficie del agar para facilitar la observación de colonias pequeñas, este medio contiene: 0,5% de peptona como fuente de nitrógeno, 0,01% de glucosa como fuente de carbono, 0,3% de extracto de carne, 1.5% de agar, 0,5% de cloruro de sodio, agua destilada, con pH de 6,8 a 7,2; se esteriliza a 121°C durante 15 minutos, y se procede hacer la siembra por rejilla en el medio ya listo. (Lab, 2015)

Siembra por rejilla en medio de cultivo Agar nutritivo

Se toma el asa redonda, se esteriliza poniendo el asa en la llama del mechero a 750°C, hasta que esta se ponga roja, posteriormente se enfría con el interior del vidrio donde se encuentre la muestra, luego sumergimos el anillo del asa en la muestra permitiendo que dentro del anillo se forme una película del líquido, (todo estos procedimientos se realizan cerca al mechero para evitar la contaminación del agar y del caldo), luego de recogida la muestra en el asa, esta se introduce en la caja con el medio de agar nutritivo, y se procede a realizar movimiento en zig-zag desde el centro de la caja hasta la orilla de la misma, sin mucha presión para no romper el agar, se saca el aza, se esteriliza en el mechero, se gira la caja Petri un cuarto de vuelta a 90°, se introduce el aza en una parte limpia del agar para enfriamiento, y se procede a repasar desde el centro de la caja hacia fuera, el procedimiento se repetirá 4 veces, consiguiendo que la muestre quede bien distribuida en cada giro de la caja. Al terminar este proceso se esteriliza el asa para eliminar microorganismos y evitar contaminación, se cierra la caja Petri y se incuban las cajas boca abajo a 25°C De 24 a 48 horas, y posteriormente se almacenan en la nevera a 4°C para su siguiente procedimiento.

Purificación de microorganismos

En la purificación de microorganismos se tiene por objetivo recoger una cepa pura, es decir una única colonia con las mismas características morfológicas, metabólicas, etc. para un posterior análisis macroscópicos y microscópicos, para ello se realizó una siembra en masa en tres cajas Petri conteniendo cada una un organismo de los seleccionados en el aislamiento. Cada caja Petri contiene medio de tipo Mayeux que permite seleccionar el crecimiento de una sola especie. El medio Mayeux para bacterias, que contiene 10g de peptona, 5g de extracto de levadura, 100g de sacarosa, 1g de citrato de sodio, 5g de glucosa, 2,5g de gelatina, 15g de agar en un litro de agua, se sometió a calentamiento hasta hervir durante 2 minutos aproximadamente y se procede a esterilización en autoclave a 120°C durante 30 minutos a un presión de 15 psi, (Cuervo Mulet, Ledesma, Duran Venegas, & Argote Vega, 2010) y posteriormente se sirve en cajas de Petri donde se solidifico a temperatura ambiente, lo siguiente fue realizar las siembras de los organismos con mayor crecimiento y dominio en la caja de aislamiento; para ello se realizan las siembra por estría, (Microbiologia, 2018) es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos que están formados por un solo organismo o cepa. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie del medio Mayeux preparado anteriormente en la caja Petri; conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. Posteriormente, las cajas se incuban boca abajo a 25°C De 24 a 48 horas, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles.

Pruebas macroscópicas y microscópicas de la cepa Leuconostoc mesenteroides.

Las bacterias aisladas del jugo de caña, presentaban colonias de forma circular, superficie lisa, traslúcida, color crema, consistencia viscosa, de gran tamaño, elevación convexa, borde entero con formación de dextrana, lo cual concuerda con las características macroscópicas reportadas por la literatura para el género Leuconostoc. Se pudo observar además que la bacteria es un cocobacilo gram (+), agrupadas en pares o cadenas cortas, con ausencia de esporas y con presencia de cápsula. (Cuervo Mulet, Ledesma, Duran Venegas, & Argote Vega, 2010)

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