DETECTORES EN CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

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DETECTORES EN CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

No hay detectores para cromatografía de líquidos tan universalmente aplicables como los detectores de ionización por llama y conductividad térmica para cromatografía de gases.

Los detectores de cromatografía de gases fueron específicamente perfeccionados para medir pequeñas concentraciones de analitos en flujos de gas. Por otro lado, los detectores de cromatografía de líquidos han sido instrumentos analíticos tradicionales adaptados con celdas de flujo para medir concentraciones bajas en flujos de líquidos. El problema principal en el mejoramiento de la cromatografía de líquidos es la adaptación y perfeccionamiento de dichos dispositivos.

El detector ideal para la cromatografía de líquidos debería poseer todas las características que se mencionan respecto a los detectores de cromatografía de gases;

1. Sensibilidad adecuada. Justo lo que constituye una adecuada sensibilidad no puede evaluarse de forma cuantitativa. En general las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2. Buena estabilidad y reproductividad.
3. Respuesta lineal para los solitos que se entienda a varios ordenes de magnitud.
4. Intervalo de temperaturas desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C.
5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo.
6. Alta confiabilidad y manejo sencillo. El detector debería estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos, si es posible.
7.  Respuesta semejante para todos los solitos o por el contrario una respuesta selectiva y altamente predecible para uno o más tipos de solutos.
8. No debe destruir la muestra.

Solo que existen unas excepciones; un detector de cromatografía de líquido no requiere ser sensible en intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo con el fin de reducir el ensanchamiento de banda y ser compatible con el flujo de líquidos.

Los detectores para cromatografía de líquidos son de dos tipos. Los detectores basados en una propiedad de la solución son sensibles a una propiedad de la fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En cambio, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades de este último, como la absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no son inherentes a la fase móvil.

Ultravioleta-visible

Los primeros detectores de absorción fueron los fotómetros de filtro con una lampara de mercurio como fuente. Lo más común era aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se podían utilizar las líneas a 250, 323, 334 y 365.

Los instrumentos más versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o wolframio, y un monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda óptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.

Este se efectúa de la siguiente manera; El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño volumen (entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma. Su límite de detección oscila entre 0.1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

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Figura 1. Esquema del equipo detector de Uv-vis para HPLC.

Varios grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas, exhiben bandas de absorción anchas a una o más de esas longitudes de onda del ultravioleta.

Algunos aniones inorgánicos presentan bandas de absorción ultravioleta que son resultado de electrones no enlazantes que se excitan. Entre los ejemplos están iones nitrato (313 nm), carbonato (217 nm), nitrito (360 nm y 280 nm), azina (230 nm) y tritiocarbonato (500 nm).

Arreglo de diodos

Las partes que lo componen son: una lampara, un obturador, sistema de lentes cromáticos, celda de flujo, lentes, slit, gradilla holográfica y un arreglo de fotodiodos. De esta manera, la lampara es la fuente de luz que se encarga de proveer de energía radiante en el intervalo de longitudes de onda requerido para el análisis. Esta energía pasa por un obturador y entra al policromador que ayuda a que una gran longitud de onda pase por la muestra que se encuentra en la celda de flujo. Una vez que la luz es fraccionada en los diferentes componentes de la longitud de onda, es enfocada hacia el arreglo de diodos.

Los elementos foto-sensibles son arreglados como paquetes lineales, similares a los usados en los circuitos integrados (un elemento por cada longitud de onda analizada).

En esta serie de diodos cada diodo es un capacitor que es cargado por un circuito en el arreglo. Cuando la luz golpea el diodo este conduce una corriente y descarga el capacitor. La cantidad de electricidad descargada es proporcional a la cantidad de luz que choca en el diodo y la eficiencia quantum del diodo. La magnitud de la descarga se mide cuando el circuito intenta recargar el capacitor. Cada descarga eléctrica en cada elemento es medio separadamente. El arreglo por completo es barrido a un intervalo determinado para determinar la carga de cada elemento. La razón de barrido se obtiene a través del promedio de la energía luminosa que golpea los elementos que son capaces de transportar carga y no tienen que ser barridos frecuentemente como los elementos pequeños. Entre mas veces se efectué el barrido habrá mas oportunidades de que el ruido electrónico limite la capacidad del instrumento para distinguir entre el fondo y una señal verdadera, por lo tanto, afectando el límite de detección.

Finalmente, la señal llega a un integrador en donde se lleva a cabo el manejo de la misma. Con el adelanto de los sistemas computacionales, se logro crear programas que permiten de manera mas amigable y efectiva el análisis de la información generada por el HPLC.

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Figura 2. Esquema del funcionamiento de un detector de arreglo de diodos.

Índice de refracción

Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente que en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.

Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía de gases. Además, son fiables y no dependen del caudal pueden analizar algunos analitos como azucares. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.

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Figura 3. Esquema del funcionamiento de un detector de índice de refracción.

Quirales 

Los detectores quirales se utilizan para la detección de compuestos ópticamente activos como aminoácidos, azúcares, terpenos y otros compuestos que contienen un carbono asimétrico.

hay dos técnicas de detección quiral, polarimetría o dispersión rotatoria óptica (Ord) y dicorismo circular (cd).

Los detectores Ord se basan en diferencias en el índice de refracción y los detectores cd diferencian los enantiómeros midiendo las diferencias entre la absorción de luz y la luz polarizada circularmente a la izquierda debido a la existencia de cromóforos quirales.

Dispersión rotatoria óptica (ORD)

Es la variación en la rotación óptica de una sustancia con un cambio en la longitud de onda de la luz La dispersión rotatoria óptica se puede utilizar para encontrar la configuración absoluta de complejos metálicos. Por ejemplo, cuando la luz blanca polarizada en el plano de un retroproyector pasa a través de un cilindro de solución de sacarosa, se observa un arco iris en espiral perpendicular al cilindro.

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Dicroísmo circular (CD)

El dicroísmo circular es una técnica de espectroscopía de absorción electrónica, basada en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada.

La característica más importante de un Espectro polarímetro de Dicroísmo Circular, es que debe contar con una fuente de luz polarizada. En general un espectrofotómetro de dicroísmo circular cuenta con un generador de radiación (fuentes de carburo de silicio), que inicialmente se filtra y luego se polariza. Esta pasa por un modulador fotoelástico que consiste en un material que se comprime y expande para producir radiación circularmente polarizada (generalmente un cristal de seleniuro de zinc) la cual incide sobre la muestra bajo estudio, (disuelta generalmente en tetracloruro de carbono o en deuterocloroformo), colocada en una celda con ventanas de materiales estables (como BaF2).

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