DETERMINACION DE ZEARALENONA

ZEARALENONA

PROPIEDADES

Actúa como un producto de tipo hormonal mas que como una toxina; sin embargo, los desordenes estrogenicos que causa son serios en cerdos. Los hongos que lo producen son miembros del género Fusarium, algunas de cuyas especies reportadas como productoras de zearalenona son F. graminearum, F. monoliforme, F sporotrichioides, siendo el mas importante F. graminearum. La toxina ha sido aislada de granos.

El estrogenismo se caracteriza por infertilidad en ambos sexos de animales alimentados con granos mohosos, principalmente cerdos, en las hembras hay agrandamiento de la vulva, de las mamas y atrofia de los ovarios; en los machos se observa el crecimiento de las glándulas mamarias y reducción de los testículos.

1.2. Propiedades Químicas: Sustancia blanca cristalina, peso molecular 318; esta clasificada como una lactona de acido resorcilico. Soluble en álcalis diluidos, acetona, alcoholes, cloroformo y éter; ligeramente soluble en éter de petróleo e insoluble en agua. Punto de fusión 164-164ºC. Absorción máxima UV 236, 274 y 316 nm. Ópticamente activa. Fluoresce azul-verde con luz UV (360 nm) y mas verdoso a 260 nm. Rf 0.7 en placas de cromatografía desarrolladas en tolueno/acetato de etilo/acido fórmico (6:3:1)

EFECTOS EN ANIMALES

De acuerdo con la FAO, la concentración ZEA en (50–100 mg/kg) pueden interferir con la concepción, ovulación, implantación, desarrollo fetal y la viabilidad de animales recién nacidos. Un contenido de 14 mg/kg de forraje, se ha notificado casos de disminución de la fecundidad en bovinos.

EFECTOS EN HUMANOS

La ZEA ha sido investigada en el tejido endometrial de 49 mujeres. 27 de ellas presentaban adenocarcinoma endometrial. Otras 11 tenían hiperplasia endometrial. Y el resto presentaban características endometriales normales.

INCIDENCIA EN ALIMENTOS

La ZEA se aísla mayoritariamente en cereales simultáneamente con otras micotoxinas (incluyendo tricotecenos). Su presencia, en grandes cantidades, es debida a prácticas incorrectas de almacenamiento más que a su desarrollo en el campo.

MÉTODOS ANALÍTICOS

Las micotoxinas pueden generarse desde el campo o bien posteriormente después de la cosecha en el almacenamiento o en el procesamiento de los alimentos. Debido a su amplio rango de efectos tóxicos las micotoxinas pueden causar pérdidas económicas a los productores pecuarios y representan un riesgo para los consumidores de los alimentos que se obtengan de estas explotaciones pecuarias. Por lo tanto se hace necesario realizar ensayos rutinarios para tener idea del nivel de contaminación por estas toxinas.

5.1. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC).

La Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia junto con varios tipos de detectores como: UV, arreglo de diodos (DAD) y Fluorescencia, es la técnica más utilizada para la identificación de la mayoría de micotoxinas. La primera publicación que se realizó sobre análisis de micotoxinas con HPLC fue en 1973 y desde entonces ha incrementado su uso. Así, mismo se han utilizado las columnas de purificación de inmunoafinidad.

El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la columna cromatográfica.

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos que ayudan a la separación de los compuestos.

5.1.1. Tipo de HPLC utilizado: cromatografía de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la sílica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.

5.1.2. DETECTOR DE FLUORESCENCIA

La determinación se hace con este detector debido a que es de alta sensibilidad pudiendo analizar trazas.

Los compuestos fluorescentes remiten, en forma de luz, todo o una parte de la radiación de la fuente luminosa a que están sometidos. La intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración. El campo de aplicación de este detector, muy sensible y selectivo, puede ampliarse aplicando reacciones de formación de derivados fluorescentes. Para estos procedimientos se sitúa un reactor antes de la columna (precolumna), o bien entre la columna y el detector (postcolumna) para hacer una o mas reacciones sobre los compuestos fluorescentes.

5.1.3. COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD

La base de las columnas de inmunoafinidad, que consiste en una columna que contiene anticuerpos específicos (fijados a un soporte solido) contra una determinada micotoxina en cuestión. Cuando la micotoxina pasa a través de la zona de anticuerpos específicos, ésta es retenida por el anticuerpo en la columna.

Después, la columna es lavada con agua o solución de lavado adecuada para eliminar las impurezas. Pasando después por la columna una solución de elución adecuada, la micotoxina se libera del anticuerpo y puede ser extraída.

Esta solución con la micotoxina en cuestión, es preparada adecuadamente para medir la concentración por medio de la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC), con detector de fluorescencia.

DETERMINACIÓN DE ZEARALENONA EN CEREALES

Método HPLC

OBJETIVO

Detectar y cuantificar la presencia de Zearalenona en cereales.

CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

El método es aplicable a trigo, arroz, maíz.

FUNDAMENTO

Se basa en la extracción de las micotoxinas con acetonitrilo, purificación a través de columnas de inmunoafinidad. Cuantificación por HPLC con detector de fluorescencia.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

MATERIALES Y EQUIPOS

Equipo HPLC Agilent 1200

Columnas de inmunoafinidad

Homogeneizador

Erlenmeyer ámbar con tapa de 250 mL

Viales ámbar de 2 mL silanizados.

Papel filtro Whatman Nº 4 o equivalente.

Micropipetas de 200 y 1000 μL.

Matraces de aforo 10 mL ámbar.

REACTIVOS

Estándar de Zearalenona (ZEN) 22 µg/mL

Acetonitrilo, grado HPLC

PBS (solución buffer salina)

Metanol, grado HPLC

Solución extractante CH3CN (acetonitrilo)-H2O (85:15)

DESARROLLO

EXTRACCIÓN.

Moler aprox. 500 g de la muestra.

Pesar 50 g de la muestra previamente molida en un matraz erlenmeyer.

Agregar 200 mL de la solución extractante Acetonitrilo–Agua 84:16.

Agitar por una hora o mezclar a alta velocidad por 3 min en homogeinizador. Homogenizar a alta velocidad o agitar vigorosamente durante una hora usando un agitador mecánico.

Filtrar a través de un filtro plegado y recolectar el filtrado en material ámbar.

PURIFICACIÓN POR COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD

Tomar 10 mL del filtrado en matraz volumétrico de 50 mL y aforar con PBS.

Tomar una alícuota de 20 ml para pasar a través de la columna de inmunoafinidad especifica para zearalenona (la micotoxina es retenida en la columna por el anticuerpo monoclonal).

Dejar escurrir el líquido que contiene la columna y detener el flujo, cerrando la llave cuando el menisco alcance el tope del relleno.

Lavar la columna con PBS (solución buffer salina) llenando la columna cada vez por tres veces y teniendo la precaución de que no se seque.

Tomar 20 mL de la muestra filtrada y pasar por la columna instalada en el sistema.

Elusión: Colocar un vial de 2 mL silanizado bajo la columna y eluir con 1 mL de metanol por tres veces.

Evaporar a sequedad bajo corriente de nitrógeno y reconstituir a 1 mL con acetonitrilo agua 1+1.

Inyectar en el sistema de HPLC (con columna de fase reversa C18), 20 microlitros de la disolución anterior.

Analizar y cuantificar por los sistemas de HPLC

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