Determinación cuantitativa de la actividad enzimática de un preparado enzimático puro

.UNIVERSIDAD POLITÉCNICA ESTATAL DEL CARCHI [pic 1]

INDUSTRIAS AGROPECUARIAS Y CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA DE ALIMENTOS

ANÁLISIS DE ALIMENTOS II  

Integrantes: Juliana Chamorro- Jennifer Ganán- Jefersson Moncayo- Antonio Pilatuña-   Daisy Pucachaqui.

Práctica Nº: 2                                                

Docente: Dra. Jenny Yambay                        

Semestre: 5to “B”

Fecha: 14-05-18

Tema: Determinación cuantitativa de la actividad enzimática de un preparado enzimático puro.

Resumen

        El presente informe se refiere a la determinación cuantitativa de la actividad enzimática de un preparado enzimático puro, teniendo como objetivo realizar una curva de calibración para determinar la concentración de almidón residual que queda en el tubo problema. Por lo cual se hace uso de la siguiente metodología; se preparó 6 tubos de ensayo enumerándolos del 0 al 5 y se colocó en cada tubo la cantidad de soluciones indicadas, una vez adicionado todas las soluciones en los tubos, se tiene un color azul oscuro es decir a mayor cantidad de almidón, mayor intensidad de color, por ello se procede a llevar en orden las  muestras al espectrofotómetro, con una longitud de onda de 550 nm para obtener la absorbancia y transmitancia. Finalmente se procedió a realizar la curva de calibración para determinar la cantidad de almidón residual, dando como resultado la ecuación  y un coeficiente de determinación de 0,992; esta ecuación sirve para  determinar la concentración final y así calcular el almidón residual, por lo tanto los datos obtenidos en el espectrofotómetro no fueron los valores deseados pero si los valores adecuados para formar la recta y obtener la ecuación. El valor residual se dio en el tubo problema, ya que el almidón y la enzima reaccionan entre si dejando una [Almidón] residual, la cual no fue detectada por distintos factores, dando como resultado 1,35 ppm, este valor establece cuantitativamente la actividad enzimática de un preparado enzimático puro, teniendo en cuenta que una elevada temperatura produce un cambio de conformación de la enzima y esta enzima pierde la actividad enzimática y por tanto no degrada completamente al almidón.[pic 2]

Palabras Claves: Curva de calibración, espectrofotómetro, residual.

Introducción

El presente informe se refiere a la determinación cuantitativa de la actividad enzimática de un preparado enzimático puro, en base a este tema se puede definir la enzima como un catalizador biológico, por ello las enzimas son proteínas altamente especializadas que catalizan numerosas reacciones en los sistemas biológicos. Una propiedad importante es su especificidad a la hora de reaccionar con sustratos, acelerando determinadas reacciones químicas en disolución. Las reacciones bioquímicas a muy altas velocidades, no se consume durante la reacción y en general presenta un elevado grado de especificidad.

La cantidad enzimática se produce a cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones es decir esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de  sustrato transformado en cierto tiempo. La medida de actividad enzimática es de importancia para la investigación y análisis de proteínas. La característica principal de la actividad enzimática es modificar las velocidades de la reacción directa e inversa en la misma proporción, por lo que no alteran la constante de equilibrio de la reacción, disminuyen la energía de activación.

Las reacciones químicas pueden llevarse a cabo con o sin la ayuda de catalizadores, está reacción química en contacto físico con los reactivos, acelera, induce o propicia dicha reacción sin actuar en la misma, de esta manera la reacción es catalizada. La velocidad de las reacciones enzimáticas depende de varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración de sustrato y de enzima, entre los más importantes se encuentran:

Concentración de sustrato: A mayor concentración de sustrato, a una concentración fija de las enzimas se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración de sustrato no tiene efecto en la velocidad de reacción.

Concentración de enzimas: Cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de enzima aumenta la velocidad enzimática hasta cierto límite.

Temperatura: Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiado, la enzima pierde su actividad.

pH: La actividad de las enzimas depende de la concentración de iones hidronio del medio, ya que esto afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la proteína, incluyendo a los del sitio activo, del sustrato o del complejo enzima-sustrato.

Sin embargo se ha propuesto  la Curva de calibración para determinar la concentración de una sustancia [Almidón] en varias muestras, sobre todo en disoluciones, para lo cual se utilizó el  método de espectrofotometría el cual se basa en la relación proporcional entre la concentración y una determinada señal analítica y sirve específicamente para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones.

Por lo anterior mencionado el problema se enfoca en la determinación de la cantidad de almidón que no reacciono en la reacción química en presencia de catalizador puro (papaína) esta es una mezcla compleja de enzimas es una proteasa sulfhídrica que tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos donde los residuos de aminoácidos aromáticos del grupo carbonil son arginina, lisina o glutamina.  Las reacciones químicas pueden llevarse a cabo con o sin la ayuda de catalizadores, pero el poder catalítico de las enzimas es sorprendente. Las enzimas tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas de manera muy específica; es decir, su intervalo de acción se limita a un determinado tipo de compuesto que debe reunir ciertas características estructurales para que pueda ser utilizado como sustrato. El objetivo de este informe es realizar una curva de calibración para determinar la concentración de almidón residual que queda en el tubo problema.

Materiales y métodos

Durante la elaboración del presente informe se hace uso de la siguiente metodología. Se comenzó con la lectura de la guía de laboratorio, luego se procedió a pesar los 20 g de papaya y hacer los cálculos para preparar el cloruro de potasio 0,154 M dándonos como resultado 0,5737 g de KCl, el cual fue pesado en un vidrio reloj en la balanza analítica, la cantidad pesada se pone a secar en la estufa por media hora, luego se puso a enfriar en un desecador, posteriormente se procedió a hacer un trasvase cuantitativo del reactivo a un balón aforado de 50 ml el cual  tenía 30 ml de agua destilada, se adiciono el reactivo, se homogeniza, se afora y se rotula la cantidad que se preparó.

Después se procede a preparar el almidón (400 ppm) el cálculo de este dio como resultado 0,02 g  el cual fue pesado en la balanza analítica, mientras en un vaso de precipitación de 50 ml  se tenía 40 ml de agua destilada calentando sobre un reverbero y cuando este estaba ebullendo se hizo el trasvase de los 0,02 g de almidón, se saca y se deja enfriar, luego se procede a llenar en el balón aforado de 50 ml se homogeniza, se aforo y se rotulo.

Luego se procede a preparar el HCl (ácido clorhídrico) 0,1 N, dándonos como resultado 0,365 g de HCl ósea 0,83 ml de HCl se procede de la misma manera que el caso del KCl.

Preparamos 6 tubos de ensayo enumerándolos del 0 al 5, se procede a colocar las soluciones siempre utilizando las pipetas adecuadas para cada medida, menos cloruro de potasio, al tubo cero no se le adiciona almidón. Una vez adicionado todas las soluciones se tiene un color azul oscuro en los tubos y se procede a llevar en orden las  muestras al espectrofotómetro, solo de la 1 a la 5 se obtiene los datos de la absorbancia y transmitancia medidas con una longitud de onda de 550 nm, se anotó los datos para posteriormente hacer la curva.

Por otro lado se tritura la papaya en el mortero y luego se adiciona cloruro de potasio con la ayuda de una pipeta, enseguida se filtró y lo que se obtuvo de este filtrado se llevó a la centrifuga por 10 minutos, luego se toma 0,1 ml de esta muestra se pone la misma cantidad en 2 tubos (tubo blanco y problema) a continuación se los lleva al espectrofotómetro, calibrado a 550 nm para obtener la absorbancia y transmitancia. Finalmente se procedió a realizar la curva de calibración para medir la actividad enzima y la cantidad de almidón residual.

Resultados y Discusión

Resultados

En el análisis correspondiente de la determinación cuantitativa de la actividad enzimática de un preparado enzimático puro, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reacción. La cantidad de  una enzima en una disolución determinada o en un extracto de tejido, puede determinarse cuantitativamente en relación al efecto catalítico que produce.

La relación entre concentración del almidón y la absorbancia es proporcional y se grafica el valor de intensidad de color medido con el espectrofotómetro en función de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de almidón, mayor cantidad de producto de reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color, por ello la cantidad de almidón y las cantidades utilizadas, se las detalla en la tabla 1, estos se utilizaron para la elaboración de la curva de calibración, la cual se puede observar en la figura 1 (cantidad [Almidón]-Absorbancia). Los  tubos (1-5), presentan una reacción entre el almidón y el lugol, el cual hace que los tubos se tornen de un color azul, dependiendo de  la cantidad de almidón que se utilizó, en consecuencia la absorbancia va disminuyendo y la transmitancia de una sustancia en solución hace relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra.

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