Determinación de presencia de Patógenos por MD

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1. FUNDAMENTO

El Sistema de Detección Molecular 3M (MDS) permite la detección específica y rápida de patógenos (Salmonella, Listeria monocytogenes y Cronobacter) en muestras enriquecidas de alimentos y muestras ambientales de donde se procesan alimentos.

Esta técnica se basa en la amplificación isotérmica mediada por asas para amplificar rápidamente secuencias de ácidos nucleicos con una alta especificidad, combinada con bioluminiscencia para detectar la amplificación. Los resultados presuntivos positivos se reportan en tiempo real, mientras que los resultados negativos se revelan una vez terminado el ensayo.

1. EQUIPAMIENTO

1.- Materiales y Equipos

• Equipo Sistema de Detección Molecular
• PC con los siguientes requisitos mínimos informáticos

• Microsoft Windows XP SP3, o Vista, o Windows 7 (de 32 a 64 bits)
• Procesador Intel Pentium a 4 2.0 GHz o similar.
• 2GB de RAM (se recomienda 3 GB de RAM)
• 20 GB de espacio disponible en disco
• Unidad de CD y DVD
• USB 2.0

• Software 3M Molecular Detection System versión 2.2.3.1 año 2015 o más actualizada.
• Calefactor eléctrico con 0,1° C de resolución a temperatura de 100 ° C ± 1° C
• Stomacher
• Bandeja de carga Rápida para MDS
• Bloque frío para MDS
• Bloque de calor para MDS
• Bolsas para stomacher
• Balanza granataría con 0,01g de resolución
• Material para pesaje estéril (cucharas, pinzas, bisturí, etc)
• Incubadora con 0,1° C de resolución a 37° C ± 1° C
• Micropipeta de 20 μm
• Campana de flujo laminar

2.- Reactivos

• Solución de cloro doméstico (hipoclorito de sodio) al 1%.
• Frascos con 225 ml de agua peptonada tamponada estéril (Salmonella y Cronobacter)
• Frascos con 225 ml de caldo demi-fraser (Listeria monocytogenes)
• Suplemento para Salmonella
• Suplemento para Listeria monocytogenes
• Kits de MDS para: Salmonella, Listeria monocytogenes y cronobacter, según corresponda.

1. ESTANDARES

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Muestras Ambientales

1. Añadir a cada bolsa de esponja 90 ml del caldo de enriquecimiento que corresponda al análisis a realizar (ver tabla N° 1).
2. Suplementar el caldo según corresponda (ver tabla N° 1) y homogenizar a mano.
3. Llevar bolsas con esponjas a incubación según muestra tabla N° 2.

Muestras de Alimentos

1. En una bolsa para stomacher, pesar 25 g de la muestra de alimento a analizar, de manera aséptica y bajo campana de flujo laminar.
2. Añadir a cada bolsa 225ml del caldo de enriquecimiento que corresponda al análisis a realizar (ver tabla N° 1).
3. Suplementar el caldo según corresponda (ver tabla N° 1) y homogenizar en stomacher.
4. Llevar las muestras enriquecidas a incubación según muestra tabla N° 2.

Tabla N° 1: Caldos de Enriquecimiento utilizados para la determinación de patógenos en muestras ambientales y alimentos.

Tabla N° 2: Temperaturas de Incubación para la determinación de patógenos en muestras ambientales y alimentos.

Nota: posterior a la etapa de incubación, las muestras se pueden guardar de 2° C a 8° C por 72 horas a la espera de realizar lectura en equipo MDS.

1. PROCEDIMIENTO

1. Invierta los tubos de lisis tapados para mezclar.

1. Destape el o los tubos de lisis que va a ocupar, quitando el tapón de goma y descartándolo.

Nota: No vuelva a tapa los tubos de lisis.

1. A partir de las bolsas de enriquecimiento, transfiera 20 μl de la muestra a un tubo de lisis. Adicionalmente, del lote de medio de cultivo estéril utilizado en el enriquecimiento, transfiera 20 μl a un tubo de lisis, este tubo será utilizado posteriormente para realizar el NC (control negativo de la corrida) y RC (control reactivo de la corrida).

1. Coloque la gradilla con los tubos de lisis en el bloque de calor, asegurándose que este se encuentre a una temperatura de 100° C ± 1 ° C. Mantenga los tubos de lisis a esta condición durante 15 minutos. El líquido contenido en los tubos de lisis se volverá amarillo durante el calentamiento.

Nota: verificar la temperatura con termómetro ubicado al interior del bloque y no con el panel del calefactor eléctrico. No tape los tubos de lisis durante la etapa de calentamiento.

1. Una vez transcurridos los 15 minutos de calentamiento, retirar la gradilla con los tubos de lisis del bloque de calor y, colocarla en el bloque frío a temperatura ambiente por 5 minutos. El líquido contenido en los tubos de lisis volverá a su estado inicial presentando una coloración rosada.

Nota: Luego de realizar la etapa de lisis de los tubos, estos pueden ser guardados de 2° C a 8° C por 72 horas a la espera de la lectura en equipo MDS.

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