EL MICROSCOPIO Y SU UTILIDAD EN MICROBIOLOGIA. COLORACIONES BACTERIANAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

PRACTICA N° 3

TEMA EL MICROSCOPIO Y SU UTILIDAD EN MICROBIOLOGIA. COLORACIONES BACTERIANAS

Respossable Alicia Cañari Miranda

INTEGRANTES:

Roger Barboza Quispe

CICLO: III

TURNO: tarde

AULA: 413

Año 2014

EL MICROSCOPIO Y SU UTILIDAD EN MICROBIOLOGIA. COLORACIONES BACTERIANAS

El microscopio óptico es una herramienta básica para la investigación microbiológica de rutina ya que el examen microscópico de los microorganismos se realiza con microscopio óptico o microscopio electrónico

En Microbiología se han empleado varios tipos de microscopios ópticos: de campo claro, de contraste de fases y de fluorescencia. El de mayor uso es el microscopio de campo claro

OBJETIVOS

-Conocimiento, identificación y manejo del microscopio óptico y sus partes

-Preparación de muestras para su observación

FUNDAMENTO

-Conociendo que el protoplasma bacteriano tiene el mismo índice de refracción que el agua, es indispensable emplear procedimientos de tinción que permita visualizar las bacterias

-En esta práctica al empezar a tener contacto con las bacterias se hace necesario utilizar colorantes a fin de hacerlas más visibles y que permita estudiar su morfología, cuya información contribuye a la caracterización, identificación y diagnóstico de género bacteriano

PARTES DEL MICROSCOPIO OPTICO

I.-PARTE MECANICA

-Brazo: es de metal, en forma de C, por la parte superior, se une con el tubo óptico y por la parte inferior con el pie o base del microscopio

-Cabezal: contiene los sistemas de lentes oculares, puede ser monocular o binocular. Interiormente se encuentra el tubo óptico, en cuya parte superior se encuentra el ocular y en la parte inferior el revolver, donde se encuentran los objetivos

-Revolver: dispositivo giratorio, que posee dos, tres o mas roscas donde se atornillan los objetivos

-Platina: plataforma de forma cuadrada y que se utiliza para colocar la preparación a observarse

-Tornillos de enfoque: el macrométrico y micrométrico, que permiten el enfoque de la muestra con el objetivo de menor aumento

-Pie o base: tiene forma circular o de herradura y sirve de apoyo del microscopio

II.-PARTE OPTICA

-Oculares: cilindros cortos y huecos, que se colocan en la parte superior del tubo óptico. En la parte externa de estas lentes se indica el poder de amplificación: 4X, 10X, 15X

-Objetivos: tubos cortos atornillados al revolver. Sistema de lentes, cuyo poder de amplificación puede ser: 4X, 10X, 20X, 40X, 100X

-Condensador: se encuentra debajo de la platina y su función es concentrar los rayos luminosos sobre la preparación

-Diafragma: permite regular la intensidad de luz proyectada a la apertura de la platina

-Luz: fuente de luz

MANEJO DEL MICROSCOPIO

Las siguientes recomendaciones se deberán tomar en cuenta para el uso correcto del microscopio

1.-Levante completamente el condensador

2.-Abra el diafragma completamente

3.-Haga girar el revolver de los objetivos y enfoque el objetivo de menor aumento

4.-Coloque la lámina portaobjetos sobre la platina y asegúrela

5.-Mirando lateralmente, mueva el espejo hasta que la lámina portaobjetos sea iluminada, cierre el diafragma

6.-baje el objetivo hasta más o menos medio centímetro de la altura de la lámina y empiece a subir lentamente hasta que focalice el frotis con el ocular

7.-Ajuste el espejo hasta que tenga usted una iluminación extensa y uniforme. Centre la fuente luminosa

8.-Ajuste la altura del condensador para la posición que le de la luz más fuerte y uniforme

9.-Abriendo parcialmente el diafragma, tendrá la luz adecuada para su observación

10.-Para usar el objetivo seco de mayor aumento, haga girar el revolver después de haber enfocado con el de pequeño aumento

11.-Para usar el objetivo de inmersión siga las instrucciones siguientes:

Enfoque un campo apropiado con el objetivo de menor aumento

Levante el condensador y abra el diafragma

Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el frotis

Cambie por el objetivo de inmersión procediendo con mucho cuidado y termine de enfocar usando el tornillo micrométrico

12.-Cuando termine de observar, limpie el lente de inmersión con papel lente, el objetivo de menor aumento deberá estar en posición cuando el microscopio se va a guardar

13.-Si el microscopio a usarse posee iluminación directo, se obviaran los pasos 5 y 7

DETERMINACION DEL AUMENTO DE OBSERVACION

Se consigue multiplicando el aumento del ocular por el aumento del lente objetivo en posición de observación y el producto es el aumento total

Ejemplo:

Ocular : 10X

Objetivo: 10X

Aumento: 100X

COLORACIONES MICROBIANAS

La morfología de las bacterias se puede examinar de 2 maneras:

-Observando los microrganismos vivos en suspensión

-Observando las células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración

OBJETIVOS

-Diferenciar a los microrganismos por su capacidad tintoreal

-Relacionar la diferencia en composición de pared celular de acuerdo a la coloración de Gram

FUNDAMENTO

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes básicos es manifiesta, si tomamos en cuenta su principal contenido de ácidos nucleicos

Los colorantes de mayor aplicación son los derivados del alquitrán de hulla (anilinas): Cristal violeta, violeta de genciana, fucsina básica, safranina, azul de metileno y verde de malaquita y van a actuar mejor mediante la adición de mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmática

Para una buena tinción hay que tomar en cuenta:

-La naturaleza de la bacteria

-Edad del cultivo muestra y

-Una buena aplicación de la técnica

COLORACION POR EL METODO DE GRAM

Es uno de los principales métodos de amplia utilidad para clasificar a las bacterias en 2 grandes grupos: Gram (+) y Gram (-). Las primeras toman el violeta de genciana tiñéndose de azul violáceo y las segundas pierden el violeta de genciana al ser lavadas con el diferenciador alcohol acetona; es necesario imprimirle un colorante de contraste: fucsina o safranina, para ser observadas tiñéndose de rojo

La teoría aceptada, asocia la gram positividad con el complejo que se forma entre el cristal violeta y el ribonucleato de magnesio de la pared celular bacteriana en presencia del iodo, que actúa como mordiente estimulando ciertas porinas de la pared de las bacterias resistiendo así la acción solvente del alcohol acetona

ETAPAS A SEGUIR

1.-EXTENSION O FROTIS

La lámina debe ser transparente, desengrasada y limpia. Si el cultivo es líquido, con el asa de siembra en aro esterilizada previamente al rojo, tomar 1 – 2 gotas y extender suavemente sobre el centro del portaobjetos. Si el cultivo es sólido, primero colocar con el asa 1 gota de agua destilada estéril sobre el portaobjetos y luego tomar el inóculo, emulsionar y extender igual que en la anterior

2.-FIJACION

Someter el frotis a la llama del mechero con calentamiento moderado

3.-COLORACION

-Cubrir la extensión fijada con la solución colorante ensayada: cristal violeta por 60 segundos. Evitar evaporación por el tiempo que debe actuar. Lavar con agua destilada

-Agregar solución iodada (lugol) por 60 segundos. Lavar con agua destilada

4.-DECOLORACION

-Decolorar con alcohol acetona por un tiempo breve. Lavar con agua destilada

5.-COLORACION DE CONTRASTE

-Colorear con solución de safranina por 60 segundos. Lavar con agua destilada. Dejar secar al ambiente, colocando el preparado en plano inclinado para el escurrimiento y con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede acelerar el secado con el calor del mechero, evitando sobrecalentamiento.

6.-OBSERVACION

Observar al microscopio con lente de inmersión y aceite de cedro

COLORACIONES ESPECIALES

OBJETIVO

Evidenciar las diferentes estructuras microbianas mediante coloraciones específicas

COLORACION DE ESPORAS

Las especies de los géneros Bacillus y Clostridium, producen unas estructuras llamadas endosporas. La endospora es muy resistente y puede sobrevivir largos periodos de tiempo e incluso en medios desfavorables, altas temperaturas o sustancias químicas.

Cuando se colorea con Gram y colorantes simples, las esporas aparecen como huecos no teñidos dentro del cuerpo bacteriano. Para ver mejor esta estructura, se usan métodos especiales de coloración. Ejemplo: coloración de azul de metileno de Looflfler

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN

Es llamada también coloración de microrganismos ácido resistentes. Es una coloración diferencial que actúa fuertemente sobre un grupo de microrganismos llamados ácido-resistentes, porque toman el colorante en caliente y resisten a la decoloración frente a alcoholes y ácidos fuertes. Esta tinción se emplea para el diagnóstico y estudio de Tuberculosis. Colorantes empleados: solución de fucsina básica fenicada al 5 % y solución de azul de metileno

...