ESTUDIOS DE LA CINÉTICA DE LA ENZIMA α-AMILASA SALIVAL

Introducción

La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad a las que transcurren las reacciones biocatalizadas por enzimas, los factores capaces de transformarla y los mecanismos por los cuales transcurre.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se define como la cantidad de sustrato transformado por la enzima en la unidad de tiempo. Esto depende de la cantidad de complejo E-S que se forma y la facilidad con que el mismo logra descomponerse posteriormente. Cualquier factor capaza de modificar lo anterior influirá en la velocidad de reacción.

La enzima α-amilasa, presente en la saliva, digiere inicialmente hidratos de carbono -principal fuente de la dieta humana- tales como el almidón.

El almidón es la principal fuente de reserva de glúcidos que poseen las plantas y abunda en los tubérculos como la patata y en diversos cereales, entre otros arroz, maíz y trigo.

El almidón es una mezcla de homo polisacáridos llamados amilasa y amilopectina.

• Amilosa: consiste en un cadena lineal dispuesta en forma helicoidal, constituida por 250 a 3000 unidades de D-glucosa, unidas entre sí por enlaces α-glicosídicos 1:4.

• Amilopectina: macromolécula de mayor tamaño que la amilasa, contiene hasta varias decenas de miles de unidades de D-glucosa. Consta de una cadena de moléculas de glucosa unidas por enlaces α-glicosídicos 1:4, pero también posee uniones α-1:6, los cuales representan los puntos de ramificación. Su mayor tamaño y la presencia de ramificaciones hacen que la amilopectina sea menos soluble en agua que la amilasa.

La enzima α-amilasa, es una enzima de naturaleza gluproteica que existe en seis formas moleculares (isoenzimas), diferentes por su composición en aminoácidos o contenido en glúcidos. Tiene un pH óptimo de 6 a 8, siendo en Cl- su principal activador. Esta enzima hidroliza al azar los enlaces α (1:4) que unen residuos de glucosa en almidón, a excepción de los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de ramificación de las cadenas. Por la acción de esta enzima, en la boca la longitud de la cadena del almidón se reduce de varios miles a unas ocho unidades de glucosa. La alta concentración de protones del estómago inactiva la α-amilasa salival. La digestión del almidón continúa en el intestino delgado por la acción de la α-amilasa pancreática, como producto se forma una mezcla del disacárido maltosa, el trisacárido maltotriosa y oligosacáridos conocidos como dextrinas que poseen ramificaciones α (1:6).

Objetivos

 Análisis de la cinética enzimática.

 Comprender la importancia del papel funcional de las enzimas.

 Comprobar la influencia de la concentración del sustrato de la concentración de enzima, el pH y la temperatura de la cinética del enzima α-amilasa salival en su acción sobre los enlaces α-1:4 del almidón

 Desarrollar destrezas en el manejo del material de laboratorio.

Materiales y Reactivos

1. Solución de enzimas: se prepara recolectando 1ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyendo hasta 20 ml con agua destilada.\\

2. Solución de Almidón al 0,5%

3. Solución de Lugol: se prepara disolviendo 1g de I,2g de Kl en 200ml de agua destilada

4. Soluciones Buffer de ph 5,0 ; 6,8 y 8,0

5. Tubo de ensayo, gradillas, pipetas, placa de porcelana con escamaduras, vaso de precipitado, baño de agua termostatizado, cronometro

Experimento 1: Estudio de la influenza de [E]

Procedimiento

1. Añada en cada uno de cuatro posillos:1 gota de solución de almidón al 0,5 %

2. Añada a cada posillo 1 gota de las diluciones de enzimas (1:100, 1:200 y 1:400), inmediatamente después de a adicionar la solución de la enzima al ultimo tubo ponga en marcha el cronometro y comience a medir el tiempo del cronometro. En el posillo control, deberá agregarse todos los reactivos, excepto la dilución de enzimas.

3. a los 15 minutos compruebe la reacción en el posillo agregando una gota de la solución de Lugol. Observe y anote el color para cada posillo ensayado.

Resultados

Reactivo/Pocillo 1 2 3 Control

Sustrato Almidón 2gotas Almidón 2gotas Almidón 2gotas Almidón 2gotas

Enzima 1/10 2 gotas 1/100 2 gotas 1/200 2 gotas

Solución de lugol 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas

...