EXTRACCIÓN DE ADN HUMANO A PARTIR DE SANGRE TOTAL

EXTRACCIÓN DE ADN HUMANO A PARTIR DE SANGRE TOTAL

ASTRID CAROLINA RODRÍGUEZ SÁNCHEZ- 17182070

GRUPO A1

Biociencias II Medicina

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

02/02/18

INTRODUCCIÓN:

La investigación de la genética, que ha avanzado más en el último medio siglo, ha desatado una auténtica revolución de conocimiento. El ADN, si lo sabemos interpretar, es nuestro manual de instrucciones. En cada célula encontramos toda nuestra información genética. Estos datos genéticos nos permitirán implementar una medicina tipificada, como, de hecho, ya nos permiten en ciertos campos, como el diagnóstico genético de enfermedades.

El ADN se puede extraer mediante métodos como el salting out, Resina chelex, Fenol cloroformo entre otras técnicas que permitirán hacer estudios moleculares más detallados y con más certeza, dándonos como fin, un resultado especifico.

PALABRAS CLAVE:

Extracción, ADN, genéticos, salting out.

OBJETIVO GENERAL:

Extraer ADN genómico a partir del método salting out.

MATERIALES Y REACTIVOS:

1. LISTA DE QUIPOS:

• Timer
• Agitador
• Centrifuga para tubos de ensayo
• Vortex.

1. LISTA DE MATERIALES:

• Tubo con anticoagulante EDTA (tapa lila).
• 2 tubos de polipropileno.
• Un tubo eppndorf de 1.5ml.
• Micropipeta de 200 y 1000ul.
• Puntas para micropipeta.
• Recipiente para desechar tubos y material biológico.
• Centrífuga.
• Gradillas.
• Guantes.
• Tapa bocas.

1. BUFFER DE LISIS I:

• Sucrosa 0.3M.
• Tris HCL 10mM pH7.5.
• Cloruro de magnesio 5mM.
• Titon 100x.

1. BUFFER DE LISIS II PH8.0

• EDTA de sodio pH8.
• NaCl.
• SDS10% (sodio dodecil sulfato).
• Perclorato de sodio 5M.
• NaCl 6 Molar.
• Etanol 70%
• Isopropanol.
• Agua destilada.

PROCEDIMIENTO (METODOLOGÍA):

1. Usar guantes y tomar 1 ml de sangre de un voluntario (estudiante) en un tubo con EDTA y homogenizar rápidamente para evitar coagulación.
2. Pasar la muestra de sangre a un tubo de polipropileno, agregar buffer de lisis I hasta 5 ML tapar y mezclar suavemente por inversión hasta 10 veces.
3. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm. (revoluciones por minuto)
4. Retirar el tubo, descartar el sobrenadante dejando escurrir bien los tubos sin desprender el botón celular que se encuentra en el fondo del tubo.
5.  Adicionar 450 uL de buffer de lisis II, 3uL de SDS 10% y 1 uL de perclorato de sodio 5M. Tapar el tubo y mezclar en vortex durante 10 segundos.
6. Agregar 200 uL de NaCl 6M, tape el tubo y mezclar fuerte en vortex. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
7. Pasar el sobrenadante (contiene el ADN disuelto) a otro tubo sin dejar pasar el precipitado en el cual quedan los restos de membranas, proteínas etc.
8. agregar 700 uL de isopropanol, tape él tuvo y mezclar suavemente por inversión hasta visualizar las fibras de ADN.
9. Tomar un tubo de eppendorf de 1,5 mL con 100 uL de agua destilada. Marcarlo con el respectivo nombre.
10.  Tomar el tubo que contiene el ADN y con la ayuda de una punta envolver las fibras para retirarlas del tubo.
11. Colocar el ADN  que está en la punta e introducirlo en la bala que contiene el etanol al 70% y lavar el ADN con esta solución.
12.  Colocar el ADN en el tubo eppendorf;  donde se depositó el agua destilada. Asegurarse que se desprenda de la punta y quede depositado en el agua.
13. Tapar el tubo y guardarlo en refrigeración (2 - 8 °C).

RESULTADOS:

• Usando el método de salting out para extraer el ADN genómico a partir de sangre extraída de un estudiante, observamos cada paso o procedimiento dado para de esa misma manera extraerlo haciendo uso de este método que manipula reactivos de bajo riesgo toxico.
• Durante la aplicación de este método se observa la aparición del botón celular, la precipitación de las proteínas y al final se puede apreciar el ADN que se va a conservar en agua destilada y refrigerado.

INVITACIÓN AL ESTUDIANTE

1. ¿Cuál es el fundamento de la técnica Salting Out para la extracción del ADN?

RTA: El salting out es una técnica usada en la extracción de ADN genómico, usa reactivos de baja toxicidad. Este permite visualizar ADN a partir de 4 pasos:

1. Lisis celular.
2. Extracción.
3. Precipitación.
4. Resuspension.

Mediante esta combinación de acción mecánica y detergentes, se rompen las membranas de la célula liberándose el ADN al medio de lisis ya que estos detergentes tienen una actividad inhibitoria sobre algunas proteínas de tal manera que impiden la acción de enzimas que degradan el ADN y durante la centrifugación se eliminan restos de tejidos y células, recuperando el ADN por medio de una precipitación alcohólica con etanol o isopropanol.

1. ¿Qué métodos de extracción de ADN existen, explique cada uno?

• Resina chelex: Es una técnica inorgánica que previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%, tiene copolímeros de estireno dibenzeno-iones iminodiacetato, se alteran las membranas de las células destruyendo las proteínas y desnaturalizando el ADN por lo que resulta un ADN de cadena sencilla y no se usa en RFLPS.

• Fenol cloroformo: Es una técnica orgánica que permite aislar ADN genómico de buena calidad en 4 pasos:

1) solubilización de los componentes de la mancha

2) desnaturalización e hidrolisis de las proteínas

...