Efecto del pH del medio de cultivo y de la fuente de nitrógeno sobre el metabolismo de la cepa recombinante Saccharomyces cerevisiae pRN5

Artículo original                           Investigación-Desarrollo e Innovación  21(2)2006

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1. .Efecto del pH del medio de cultivo y de la fuente de nitrógeno sobre el metabolismo de la cepa recombinante Saccharomyces cerevisiae pRN5

Thelmo Alejandro Lu-Chau*, Enrique Roca Bordello

Escuela Técnica Superior de Ingeniería (ETSE), Dept. Ingeniería Química. Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela (15782), A Coruña, España.

(*) e-mail: eqtluch@lugo.usc.es

Tel.: +34-981563100 E-16016

Resumen

En este trabajo se estudió el efecto del pH y la fuente de nitrógeno utilizada en la formulación del medio de cultivo sobre el metabolismo de una cepa recombinante de la levadura Saccharomyces cerevisiae (pRN5). Esta cepa contiene múltiples copias del gen homólogo exg1 que codifica la expresión del enzima exo-ß-glucanasa. Se observó que para mantener el crecimiento celular de la cepa recombinante es necesario mantener un pH del medio de cultivo superior a 2.3. Por otro lado, los mejores resultados de velocidad máxima de crecimiento y rendimiento en biomasa del sustrato se obtuvieron utilizando una fuente orgánica de nitrógeno. Los resultados obtenidos serán utilizados en la formulación del medio de cultivo en posteriores estudios de aplicación de estrategias operacionales orientadas a optimizar la producción del enzima exo-ß-glucanasa en cultivos llevados a cabo en bioreactores.

The effect of pH and nitrogen source of the culture medium on the metabolism of a recombinant strain of the yeast Saccharomyces cerevisiae (pRN5)

Abstract

In this work the effect of pH and nitrogen source of the culture medium on the metabolism of a recombinant strain of the yeast Saccharomyces cerevisiae (pRN5) was studied. This strain bears multiple copies of the homologous gene exg1, which codifies the expression of the enzyme exo-ß-glucanase. It was observed that it is necessary to keep a pH greater than 2.3 to maintain an active cell growth. Moreover, the best results of maximal growth rate and biomass yields on substrate where obtained using an organic nitrogen source. These results will be used for formulating the culture medium of subsequent studies related to the application of operational strategies aimed to optimize the production of the recombinant enzyme exo-ß-glucanase in bioreactors.

1. Introduccción

La utilización de microorganismos recombinantes en la producción de proteínas es uno de los temas más innovadores que se están desarrollando actualmente en el campo de la biotecnología. En el presente trabajo se ha utilizado una cepa recombinante de la levadura Saccharomyces cerevisiae que sobreexpresa el producto del gen homólogo exg1 como un sistema modelo para estudiar los procesos de inestabilidad plasmídica y expresión genética de cultivos recombinantes. El gen exg1 codifica la expresión del enzima exo-ß-glucanasa (EC.3.2.1.58). Las exo-ß-glucanasas desempeñan un papel importante en diversos procesos morfogenéticos de la célula. Su principal función es la hidrólisis de los enlaces ß-O-glucosídicos de las cadenas de ß-glucanos, liberando glucosa.

Las células recombinantes presentan ciertas desventajas frente a las células que no portan plásmidos debido a la mayor carga metabólica requerida durante la expresión de la proteína recombinante y el proceso de replicación plasmídica. Por esta razón es necesario determinar las condiciones del medio de cultivo que permitan disminuir estas desventajas. Así por ejemplo, se han reportado diferencias en la estabilidad plasmídica entre células que crecen en medio sintético (con una formulación definida de nutrientes) y otras que lo hacen en medio complejo. Algunos investigadores han observado una mayor estabilidad plasmídica (Chiruvolu et al, 1996, O’Kennedy et al, 1997) y una mejor expresión genética (Wang y Da Silva, 1993) al utilizar medios de cultivo complejos.

Las condiciones ambientales también pueden influir notablemente sobre las células recombinantes. En general se ha observado que condiciones adversas del medio de cultivo como el pH (Georgiou et al, 1988; Koslov et al, 1995), la presencia de sustancias inhibidoras (Koh et al, 1992; Gschaedler et al, 1994; van de Walle y Shiloach, 1998) ó el nivel de oxígeno disuelto (Caunt et al, 1989; Lu-Chau et al, 2004) afectan en mayor medida a las células que portan plásmidos. La sobreexpresión de un gen tiene diferentes consecuencias sobre el metabolismo celular. Las diferencias entre las células que sobreexpresan este gen y las que no lo hacen se pueden apreciar al determinar el comportamiento cinético y la distribución de los flujos metabólicos.

Materiales y métodos

1. Microorganismo

En todas las fermentaciones se empleó la cepa recombinante Saccharomyces cerevisiae pRN5, que porta multiples copias del gen exg1, el cual le permite sobreexpresar el enzima exo-ß-glucanasa. El proceso de obtención de esta cepa recombinante ha sido descrito por Nebreda et al (1986).

1. Preparación del inóculo

En las fermentaciones con la cepa Sc pRN5, el inóculo se preparó utilizando un medio de cultivo selectivo  (Lu-Chau et al, 2004). Se inoculó un matraz Erlenmeyer, con 100 mL de medio, con células conservadas a 4ºC en placas Petri. Estas células fueron posteriormente cultivadas en un agitador orbital a 30ºC a una velocidad de agitación de 150 rpm. Se permitió que las células crecieran hasta alcanzar la etapa exponencial de crecimiento. Finalmente, se concentró el inóculo mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante y se resuspendió la biomasa en una solución estéril de NaCl 0,9 % (p/v). Este inóculo se guardó en nevera a 4ºC hasta el momento de iniciar la fermentación.

Medio de cultivo y condiciones de operación.

Las fermentaciones se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 mL con un volumen de medio de 100 mL. El pH inicial del medio fue 5. Los experimentos se efectuaron por triplicado en un agitador orbital operando a una velocidad de agitación de 160 rpm y una temperatura de 30ºC.

Se utilizaron dos fuentes de nitrógeno, una orgánica y una inorgánica (Tabla 1). La formulación del resto de nutrientes para el medio de cultivo es la descrita por Lu-Chau et al (2004). En la primera serie de experimentos no se tamponó el medio de cultivo, mientras que en la segunda se empleó un tampón citrato-fosfato (4.9 g/L ácido cítrico, 6.9 g/L N2HPO4). La relación molar C/N en ambos medios fue 3.89.

Tabla 1.  Composición del medio de cultivo para el estudio del efecto de la fuente de

nitrógeno y pH.

Determinación de concentraciones de glucosa y  biomasa.

La concentración de biomasa se determinó mediante mediciones de densidad óptica a 640 nm. La concentración de glucosa se determinó utilizando un kit enzimático comercial (Reactivos SpinReact SA, España) basado en el método de Trinder.

1. Resultados

En las Figuras 1,2,3,4 se presentan los resultados del consumo de sustrato y crecimiento celular obtenidos en estos experimentos. Los datos de crecimiento microbiano se ajustaron razonablemente bien al modelo de Monod. En la Tabla 2 se presentan los datos de velocidad máxima de crecimiento. La mayor velocidad máxima de crecimiento se obtuvo en el experimento con la fuente de nitrógeno orgánico, si bien no se observaron diferencias significativas en los resultados operando con medio tamponado o sin tamponar.

En los experimentos con nitrógeno inorgánico se pudo observar claramente el efecto del pH sobre el crecimiento de la cepa recombinante. Cuando se empleó medio sin tamponar el pH del medio disminuyó hasta 2.3, en este momento de la fermentación se detuvo el consumo de sustrato y el crecimiento celular (A1). En cambio cuando se utilizó un medio tamponado (A2), se observó que las células utilizaron todo el sustrato del medio y crecieron   100%   más  que  en  el   experimento  sin

Tabla 2. Velocidad máxima de crecimiento y rendimiento en biomasa de la cepa S. cerevisiae pRN5 empleando nitrógeno inorgánico y orgánico en medios de cultivos tamponado (T) y sin tamponar (ST).

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