El nuevo Informe laboratorio de biocatálissi

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Laboratorio de Biocatalisis

EIB-359

Informe Laboratorio N°2

Francia Bellenger

Ronny Nilo

Diego Arriagada

Diciembre, 2015

Índice

Resumen        

Introducción        

Antecedentes        

Resultados y Discusiones        

Medición proteína extraída por sonicación        

Determinación de la actividad enzimática        

Medición de la concentración de proteínas en extracto enzimático purificado con solvente        

Actividad de Enzima Soluble        

Caracterización Preparado Enzimático Comercial de β-galactosidasa        

Efectos de pH y Temperatura        

Caracterización cinética de una enzima: parámetros cinéticos: Km, Vm, Ki        

Determinación de parámetros cinéticos: Vm y Km        

Discusión        

Determinación de parámetros cinéticos: Ki        

Discusión        

Conclusión        

Bibliografía        

Anexos        

Resumen

Este informe comprende un estudió de las características de β-galactosidasa de K. marxianus para el cual se exponen los resultados de tres actividades desarrolladas en el laboratorio de cinética enzimática. En el primer práctico “Extracción, purificación y concentración de la enzima”, se llevaron a cabo una serie de protocolos con el fin de realizar un análisis cuantitativo de ella, la cual es una proteína de intracelular, y debido a esta condición para rescatar a la enzima β-galactosidasa y separarla del medio, fue necesario la debilitación de la membrana celular a través de un método físico de ultrasonido llamado Sonicación, para luego llevarla a centrifugación y de esta forma separar por diferencia de pesos moleculares nuestra enzima deseada. Para obtener el contenido de proteínas resultante de la extracción y purificación se construyó una curva patrón con una proteína estándar de Albúmina de suero de bovino-BSA de la cual se obtuvo la concentración mediante el método de Bradford. De esta forma se logró obtener una ecuación lineal donde a través de esta se despejo la concentración de proteína obtenida. Luego se procedió a la purificación del extracto crudo, para luego centrifugadas y suspender en 1 [mL] de tampón fosfato, obteniéndose proteínas cuantificadas por el método de Bradford, que se traduce en un 31,81% de rendimiento de la purificación realizada.

En el siguiente práctico se realizó la caracterización cinética de la enzima mediante el análisis de su actividad en condiciones estándares y óptimas de 30°C a un pH de 6. Para poder comparar los efectos de cambio de pH y temperatura primero se debió obtener el rango lineal de actividad enzimática para lo cual se utilizaron dos concentraciones enzimáticas de 1:100 y 1:200 de donde se obtuvo un valor de periodo de 6 min. Con este periodo de tiempo se logró determinar la actividad enzimática en diferentes condiciones de pH y temperatura a la cual se sometió la enzima, logrando caracterizar de manera satisfactoria el comportamiento de la enzima.

En el último practico realizado, se obtuvieron los parámetros cinéticos de la enzima a distintas concentraciones de lactosa como sustrato (10, 20, 30, 50, 75, 100 y 125 [g/L]) de donde se obtuvo el efecto de la actividad catalítica de la enzima y sus respectivos parámetros cinéticos de V m y Km. Luego se realizó la misma experiencia pero añadiendo una determinada concentración de galactosa (5 [g/L]) que actúa como inhibidor, el cual resultó ser de tipo competitivo sobre la enzima.

Introducción

El estudio de los mecanismos cinéticos de enzimas  así como el efecto de sus inhibidores y activadores sigue siendo una herramienta útil para entender mejor la naturaleza y regulación de los parámetros operacionales y de esta forma obtener las condiciones óptimas de funcionamiento. El mejor entendimiento de los mecanismos catalíticos ha cobrado mayor relevancia biotecnológica ya que nos acerca a un mejor diseño de fármacos en el caso del tratamiento de enfermedades o para realizar modificaciones puntuales y obtener así una mayor producción de metabolitos. De esta forma, para obtener datos que permitan un mejor entendimiento de las enzimas, se  estudia los métodos de extracción y purificación a través de rendimientos y factores dados las características y/o condiciones de la enzima.

Por otra parte el comportamiento de la enzima dada las condiciones del medio es fundamental para el diseño de procesos unitarios de transformación de sustratos, por lo tanto saber los efectos del medio sobre la enzima nos brinda una herramienta indispensable tanto al saber sus limitaciones como sus potenciales. Es así que se somete a la enzima a una caracterización en condiciones estándares para después someterla a una serie de cambios con el fin de comparar los diversos efectos sobre esta misma.

Un importante aspecto de la actividad enzimática es la presencia de inhibición. La inhibición es una situación indeseable pero presente en la mayoría de las transformaciones de sustrato y debe ser estudiada, no con todo el ánimo de evitarla sino también como enfrentarla cuando aparece. Es así que esta experiencia de laboratorio busca la caracterización del efecto adverso de la inhibición a través del estudio de diferentes concentraciones de inhibidor y su respectivo efecto sobre los valores óptimos de operación. Para concretar el estudio, el efecto del inhibidor es filtrado por diferentes métodos de análisis matemáticos (que nos dirán con cierto grado aceptable de error) de qué manera es afectada la actividad enzimática y así tener una mejor herramienta para evitar dichas situaciones.

        Antecedentes        

Lactosa

Es un disacárido formado por la unión de una molécula de glucosa y otra de galactosa. Concretamente intervienen una β-D-galactopiranosa y una β-D-glucopiranosa unidas por los carbonos 1 y 4 respectivamente. Al formarse el enlace entre los dosmonosacáridos se desprende una molécula de agua. Además, este compuesto posee el hidroxilo hemiacetálico, por lo que da la reacción de Benedict, es decir es reductor.

A la lactosa se le llama también azúcar de la leche, ya que aparece en la leche de las hembras de los mamíferos en una proporción del 4 al 5 por ciento

Cristaliza con una molécula de agua de hidratación, con lo que su fórmula es: C12H22O11·H2O, luego se la puede también llamar lactosa monohidrato. La masa molar de la lactosa monohidrato es 360,32 g/mol. La masa molar de la lactosa anhidra es 342,30 g/mol.

El metabolismo de la lactosa ha sido ampliamente estudiado en las bacterias lácticas dada la relevancia económica de los productos como queso y yogur que se producen por fermentación de la lactosa presente en la leche. La lactosa puede ser transportada por el sistema fofotransferasa de transporte de azúcares y metabolizada por la ruta de la tagatosa-6-fosfato o alternativamente por una permeasa y metabolizada por la ruta de Leloir.

Β-galactosidasa

Es también llamada beta-gal y b-gal, es una enzima que cataliza la hidrólisis de galactósidos a monosacáridos. Un galactósido está compuesto por un glicósido que contiene galactosa. Es decir, el hidrógeno del grupo hidroxilo del carbono 1 de la galactosa es sustituido por un resto orgánico. Dependiendo del enlace glicosídico entre la galactosa y el resto orgánico, los galactósidos se clasifican en α-galactósidos o β-galactósidos. El β-galactósido más común es la lactosa, un disacárido entre galactosa y glucosa (β 1,4 Galactosa-Glucosa).

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