El quimerismo, la presencia de dos líneas celulares genéticamente distintas en un organismo

ESPAÑOL

El quimerismo, la presencia de dos líneas celulares genéticamente distintas en un organismo, o bien se adquiere a través de la infusión de células alogénicas hematopoyéticas durante el trasplante1 o transfusión2 o se hereda. En gemelos fraternos, el quimerismo ocurre por medio de anastomosis de vasos sanguíneos. Una causa menos común de quimerismo congénito, el llamado quimerismo tetragamético, ocurre a través de la fertilización de dos óvulos por dos espermatozoides, seguida de la fusión de los cigotos y el desarrollo de un organismo con líneas celulares entremezcladas.3 Se han encontrado ejemplos en ratones4 y otras especies de mamíferos, 5-7 incluyendo humanos.8-17 Las personas afectadas se identifican por el hallazgo de dos poblaciones de glóbulos rojos9 o genitales ambiguos y hermafroditismo, 11,15,16 solos o en combinación; tales personas a veces también tienen una piel irregular o pigmentación ocular.

Describimos a una mujer fenotípicamente normal en la que el quimerismo tetragamético se identificó inesperadamente después de que las pruebas de histocompatibilidad de los miembros de la familia sugirieron que ella no era la madre biológica de dos de sus tres hijos.

Reporte de un caso

Una mujer de 52 años tuvo insuficiencia renal como resultado de una glomerulonefritis focal esclerosante. En preparación para el trasplante renal, el paciente y su familia inmediata se sometieron a pruebas de histocompatibilidad (Figura 1A). Los resultados sugirieron que la paciente no podía ser la madre biológica de dos de sus tres hijos, que tenían el haplotipo HLA de su marido y una colección única de determinantes de HLA, en lugar de uno de los haplotipos maternos esperados (Figura 1).

En el examen, ella era una mujer fenotípicamente normal sin pigmentación anormal de la piel o los ojos. Su nacimiento no había sido notable. Se realizaron investigaciones de laboratorio adicionales, con el consentimiento informado por escrito del paciente.

Métodos

COLECCIÓN DE TEJIDO

Se obtuvieron muestras de mucosa bucal, folículos pilosos y piel; muestras de tejido tiroideo fijado a formalina se obtuvieron a partir de un nódulo tiroideo benigno previamente escindido; y tejido de la vejiga se obtuvo durante la cistoscopia. Se aislaron queratinocitos y fibroblastos epidérmicos a partir de muestras de biopsia de vejiga y también se establecieron cultivos de fibroblastos de piel, como se describió anteriormente18.

AGRUPACIÓN SANGUÍNEA Y ESTUDIOS HLA

Se usaron pruebas serológicas en tubos para el tipaje de glóbulos rojos para ABO y otros antígenos del grupo sanguíneo.19 Se usaron muestras de sangre para la tipificación serológica y molecular de los marcadores HLA clase I; clase II se realizó con el uso de métodos moleculares solo. Se usaron muestras de tejido, ya sea sin modificación adicional o después de cultivo, en el caso de vejiga y muestras de piel, para extraer ADN (QIAAMP Tissue Kit, Qiagen) para la tipificación molecular de marcadores HLA de clase I y clase II. La tipificación molecular se realizó con la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de cebador específica de secuencia 20,21 y secuencias de cebadores publicadas22 y con el uso de PCR y sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia (kits HLA Quick-Type, Lifecodes) , de acuerdo con las condiciones de amplificación descritas previamente.23 Para aumentar la sensibilidad de la detección de haplotipos, también utilizamos la amplificación por PCR anidada: la ronda inicial de amplificación consistió en 30 ciclos; Luego se eliminaron 10 μl del producto de amplificación y se usaron como plantilla durante otros 30 ciclos.24 Los haplotipos se asignaron sobre la base de los datos de los alelos obtenidos de los estudios del paciente y su familia.

ANÁLISIS CITOGENÉTICO

Los cromosomas se prepararon a partir de fibroblastos de piel cultivados y de linfocitos estimulados con fitohemaglutinina en prometafase y metafase y se tiñeron de acuerdo con protocolos estándar.25,26 Para descartar La trisomía o tetrasomía de bajo nivel, la hibridación in situ de células en interfase se realizó como se describió previamente, con el uso de una secuencia pericentromérica para el cromosoma 6 (D6Z1) .27

DETERMINACIÓN DE CROMOSOMAS SEXUALES

El gen de la amelogenina, presente en los cromosomas X e Y, se amplificó por PCR (sistemas GenePrint STR, Promega) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los cromosomas XX tienen un solo fragmento de 212 pb; Los cromosomas XY tienen fragmentos de 212 pb y 218 pb.

MARCADORES DE MICROSATIELITO DE REPETICIÓN TÁNDEM CORTA

Analizamos el número de repeticiones de pequeños motivos (dinucleótidos, trinucleótidos o tetranucleótidos) en una región determinada de un cromosoma para identificar polimorfismos genéticos. Estudiamos 22 repeticiones cortas en tándem en 16 autosomas y el cromosoma X. Utilizamos kits disponibles comercialmente para los siguientes loci: TPOX, D3S1358, FGA, D8S1179, THO1, vWA, Penta E, D18S51 y D21S11 (sistemas Powerplex 2.1 GenePrint STR, Promega); D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818 (GammaStar, sistemas GenePrint STR); FGA, D7S820, D1S533 y D9S304 (Multiplex II, Lifecode); y D12S1090, D3S1744 y D18S849 (Multiplex I, Lifecode) .28-30 Los alelos se designaron de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de ADN de la Sociedad Internacional de Hemogénesis Forense; las escalas de tamaño fueron provistas por los diversos fabricantes.31 También amplificamos el ADN utilizando cebadores marcados radiactivamente en los extremos para D2S160, D2S2216, D20S195 y DXS1073 (GIBCO-BRL, Life Technologies). Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida e identificados por autorradiografía32.

CULTIVO DE LINFOCITOS MIXTOS Y LISIS MEDIANTE CELULAR

El cultivo de linfocitos mixtos detecta antígenos de clase II incompatibles con el principal complejo de histocompatibilidad (MHC) (alelos HLA-DR y DQ) en la superficie de los linfocitos irradiados y monocitos (células estimuladoras) utilizando como punto final el grado de proliferación de las células CD4 (respondedores) de otra persona.33 En este estudio, 

el probando fue la fuente de las células respondedoras, y las células estimuladoras se obtuvieron de miembros de la familia y de cuatro sujetos normales utilizados como controles. Las células estimuladoras y respondedoras se cocultivaron durante seis días, los pocillos se marcaron con timidina tritiada y se determinó el grado de proliferación de las células CD4. El resultado se expresó como la respuesta relativa, definida como la relación de captación de timidina por las células respondedoras en respuesta a la exposición a las células estimuladoras irradiadas, en comparación con la exposición a las células control.
La lisis mediada por células se usa para evaluar la capacidad de los linfocitos CD8 para destruir células que no coinciden con los antígenos MHC de clase I (alelos HLA-A, B y C) .33 En este procedimiento, las células del probando se cultivaron con blanco irradiado celdas para crear celdas efectoras cebadas. A continuación, se añadieron células diana marcadas con cromo-51 a partir de diversas fuentes a las células efectoras en diversas proporciones de efector a las células diana. Después de una incubación de cuatro horas, los sobrenadantes se eliminaron y se analizaron. El resultado se expresó como el porcentaje de citotoxicidad específica, definida como la cantidad de cromo-51 liberada en comparación con el cromo-51 asociado a la célula total.
Resultados
EL TIPO DE SANGRE
Los glóbulos rojos del paciente eran del grupo A, Rh positivo; el anticuerpo contra el grupo B (título de aglutinación, 3+) estaba presente en su plasma. Los glóbulos rojos de su marido eran el grupo sanguíneo O, y los dos hijos de maternidad cuestionable eran el grupo A y el grupo O. Su fenotipo de glóbulos rojos era R1r (Cde / cde), K-, Fy (a + b +), Le (a- b +), P1-, M + N + S + s +, y no hubo evidencia de dos poblaciones celulares distintas.

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