Espectofotometria

RESUMEN.

La cinética de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los mismos, sus formas de aplicación, las ventajas y desventajas, y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes mecanismos de reproducción bacteriana,a partir de el estudio de un cultivo madre de levadura,preparando a partir de este diferentes soluciones con distintas concentraciones.

El conteo de células por medio de la cámara Neubauer, nos arrojó un dato de 2.95 millones de levaduras por cada ml de solución empleada.

INTRODUCCION.

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el número de microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, análisis de alimentos, preparaciones de inoculo para fermentación, etc.Un parámetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas detratamiento de efluentes líquidos es la concentración de biomasa, siendo esta un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentración de biomasa, como por ejemplo masa, volumen,extensión lineal de filamentos, dispersión de luz, conteo de células u organelas, para cuantificar el número de microorganismos o peso(biomasa) de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos eindirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.[1]

Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Como una cámara de contaje celular de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 micro litro.[2]

Otro método muy efectivo es aquel mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida, llamada así densidad, esta técnica se basa en el principio de que la cantidad de luz dispersada esproporcional a la masa de células presentes en la trayectoria de la luz. Serefiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra,en función de la longitud de onda.Cada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luzcaracterístico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo deabsorción de luz de una muestra versus soluciones estándar, es posibledeterminar la identidad y la concentración de componentes disueltos en lamuestra (solución incógnita).

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamenteproporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular delmicroorganismo.Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las célulasbacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número demicroorganismos totales o el número de microorganismos viables de unasuspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipode microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.[3]

MATERIALES Y MÉTODOS.

Conteo de biomasa microbiana por cámara de Neubauer.

Preparación del cultivo madre.

Para la preparación del cultivo madre se pesaron aproximadamente 0.5 gr delevadura seca comercial en la balanza, adicionándola en un Erlenmeyer que contenía 125 ml de agua destilada, calculando su concentración así:

mlevadura=0.5g≈500mg

vagua=125ml≈0.125L

ppm=mg/L → ppm=500/0.125 = 4000ppm

Imagen 1.

Preparación de las muestras problemas.

A partir del cultivo madre de la concentración ya especificada, se procedió a preparar las soluciones problemas, de acuerdo a los datos siguientes:

Muestra 1.

Concentración 1: 4000ppm (cultivo madre)

Concentración 2: 60ppm

Volumen 1=?

Volumen 2=10ml (volumen total)

Para determinar el volumen inicial y preparar la solución en el tubo de ensayo, se empleo la siguiente

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