Extracción De DNA Genomico, Amplificación Por PCR Del Gen AMG Y De Un Fragmento De DNA Mitocondrial

INTRODUCCIÓN

Las células de todo ser humano contienen dos tipos de DNA; DNA nuclear y DNA mitocondrial.

El ADN nuclear se encuentra en el núcleo de las células en forma de cromosomas. Cada célula tiene un único DNA nuclear, mientras que en promedio tiene entre 500-1000 moléculas de DNA mitocondrial, cifra que varía dependiendo del tipo de célula.

El DNA mitocondrial es una cadena circular de DNA que se encuentra dentro de un orgánulo de la célula llamado mitocondria que, entre otras funciones, es el encargado de producir la energía para la célula. Un ejemplo de la función de dichos orgánulos podría ser el de los espermatozoides. Ellos tienen mitocondrias en el flagelo o cola, pero no en la cabeza. Por lo tanto, en la fecundación, es sólo la cabeza del espermatozoide la que penetra en el óvulo, mientras que el flagelo se separa y cae. Por tanto, el embrión sólo recibe DNA mitocondrial de la madre, ya que los óvulos sí tienen mitocondrias. En consecuencia, el análisis del DNA mitocondrial se puede utilizar para verificar parentescos genéticos de dos personas, por “vía materna”.

El gen de la amelogenina, es un gen de copia única (homólogo) el cual esta ubicados sobre los cromosomas sexuales XY en la ubicación:

Xp22.1-Xp22.3 e Yp11.2

La secuencia de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una deleción de aproximadamente 200 pb. Esta característica, dos muestras de células epiteliales y una PCR, permiten distinguir si la persona es de sexo masculino o femenino. Utilizando un par adecuado de primers es posible amplificar el gen de ambos cromosomas. Un análisis posterior por electroforesis en gel permitiría diferenciar el gen completo del cromosoma X y el deleccionado del Y de menor peso molecular.

Para las muestras femeninas se esperaría ver una única banda, posiblemente más intensa debido a que involucra el doble de concentración de DNA que en hombres, de aproximadamente 360 pb correspondiente al gen que se hallaba en el brazo corto del cromosoma X. Para hombres esperaría verse dos bandas claramente diferenciadas, un de aproximadamente 360 pb correspondiente al gen en el cromosoma X y una de 160 pb presente en el cromosoma Y.

Las moléculas de DNA mitocondrial están constituidas en mayor parte por secuencias codificantes. Su herencia es exclusivamente materna y dado que no experimenta recombinación, independientemente del número de generaciones transcurridas, la única posibilidad de variación entre un ancestro femenino y su descendencia es por medio de mutaciones.

La frecuencia de mutaciones espontaneas es mayor que en el DNA nuclear, lo cual es producto de la combinación de diversos factores. En primer lugar la alta concentración de radicales libres y especies reactivas que se producen en el interior mitocondrial durante los procesos energéticos de síntesis de ATP. La sensibilidad de estos cromosomas se ve aumentada por la ausencia de Histonas que protejan al DNA. Una menor eficiencia de los mecanismos de reparación y de síntesis por el empleo de la DNA polimerasa Ƴ, con baja capacidad de corrección de errores durante la polimerización. Además la velocidad de síntesis es 100 a 200 veces más lenta que la nuclear, lo que permite que regiones d simple cadena permanezcan expuestas por ms tiempo y puedan ser dañadas por las abundantes especies reactivas presentes. La región del Asa D muestra los niveles más altos de mutación debido a que allí se forma una estructura de triple cadena anclada a la membrana interna mitocondrial. La cadena no apareada exhibe una altísima sensibilidad a la agresión por radicales libres.

En nuestras células existe un estado de heteroplasmia debido a la aparición de mutaciones espontaneas en la secuencia mitocondrial. Por los métodos que existen solo se detecta el genoma mayoritario. Por lo tanto se observar una variación, ese cambio en la secuencia ocurrió varias generaciones previas a través de las cuales se fue incrementando su presencia hasta poder ser detectado. Puede analizarse el polimorfismo entre personas y demostrarse la herencia materna del DNA mitocondrial mediante análisis de RFLP. La enzima Mnl I reconoce la secuencia CCTC y realiza un corte en un sitio a 7 nucleótidos de distancia downstream, por lo que reconocerá toda transición CT o TC y transversiones que hayan podido producirse y hayan generado nuevos sitios CCTC. Los diversos patrones de digestión para cada genoma pueden detectarse en un gel de poliacridamida al 10% y se comparan con la secuencia referencia de Anderson.

MÉTODOS

Extracción de ADN mucosa bucal

Primero, se frotaron las paredes bucales, encías y lengua con un cepillo estéril durante un minuto para obtener células epiteliales. Dichas células se desprendieron del cepillo en 1ml de solución buffer TE (10mM tris, 1 Mm EDTA pH=8) en un tubo eppendorf. Luego, se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 rpm y se descartó por inversión el sobrenadante. A continuación se resuspendió el pellet de células en 300 µl de buffer de digestión (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% SDS y 50mM EDTA pH=8) con agregado de proteinasa k (150 µg/ml concentración final a partir de una solución stock de 2 mg/ml), se incubó durante 2 horas a 50ºC y luego overnight a 37ºC.

Una vez finalizada la incubación, se agregó un volumen de 300 µl de LiCl 5M para solubilizar y estabilizar el DNA en la solución acuosa, y precipitar las proteínas. Se mezcló por inversión del tubo durante 1 minuto, se agregaron 600 µl de mezcla SEVAG (cloroformo/alcohol isoamilico 24:1) y se colocó en un agitador rotatorio durante 30 minutos. Se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos y se transfirió el sobrenadante, con el DNA en solución acuosa, a otro eppendorf.

Se añadieron 2 volúmenes de etanol absoluto, se agitó por inversión hasta que precipito el DNA y se centrifugó a 14.000 rpm. Entonces, se descartó el alcohol sobrenadante y se lavó el pellet de DNA con etanol 70% (1 volumen). Luego, se realizó una nueva centrifugación de 5 minutos, se descartó el sobrenadante y se secó el pellet. Para esto se colocaron los tubos invertidos sobre

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