FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

CROMATOGRAFÍA

Introducción

La cromatografía es la técnica para separar componente de una mezcla, y su posterior análisis, basada en que las distintas sustancias que forman los componentes de una mezcla se dejan arrastrar a diferentes velocidades sobre un soporte. (Ledesma, 2015)

Existen diferentes criterios de clasificación de la cromatografía: Por la naturaleza de sus fases:  

Cromatografía de gases (GC): Es una técnica muy utilizada para separar los diferentes compuestos volátiles de una muestra. La fase móvil es un gas inerte, (nitrógeno o helio) que transporta la muestra volatilizada en el inyector a través de la columna cromatográfica y la estacionaria es una columna de metil polisiloxano, o derivados de éste.

Cromatografía líquido (LC) Es una técnica POR (HPLC, de high-performance liquid chromatography) capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular, contiene una fase móvil interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa y una gran variedad de fase estacionaria lo que permite más posibilidades para la separación.(J.T, 2013)

Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases normales): Se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase móvil. (Ledesma, 2015)

Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las características de solubilidad relativa de los solutos entre la fase móvil y una fase estacionaria de un líquido no polar. La fase líquida se impregna a un soporte inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase invertida, se une químicamente.  (Ledesma, 2015)

Cromatografía de Intercambio iónico: Se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria. (J.T, 2013)

Cromatografía de afinidad: Se fundamenta en la especificidad de algunas macromoléculas biológicas. Éstas se unen específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con variar el pH una vez que la columna esté limpia y sólo se encuentre de interés. (Ledesma, 2015)

Cromatografía de Exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas. (Ledesma, 2015)

Cromatografía de partición: La fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC).

Cromatografía en papel: Es utilizada  para realizar análisis cualitativos cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento.(Ledesma, 2015)

Cromatografía en capa fina (TLC): La fase estacionaria es una capa de partículas de unos milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separación, la TLC se analizan simultáneamente la muestra y el patrón.

El grado de retención en cromatografía plana de superficie se expresa como el factor de retardación, o índice de retención Rf.ܴ݂

Rf= Distancia de desplazamiento del soluto

                          Distancia de desplazamiento del disolvente

Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema. (J.T, 2013)

OBJETIVO GENERAL

Conocer las diferentes técnicas cromatográficas, sus características y los distintos factores que intervienen en la misma, así como las ventajas y desventajas de las mismas para identificar sus aplicaciones.

OBJETIVOS ESPECÍFICO

Separación de aminoácidos por medio de una columna de intercambio iónico.

Separar los aminoácidos de la mezcla de prolina e histidina con el buffer de citratos pH 2 y pH 5.25

Confirmar la presencia de aminoácidos por medio de una reacción de color con Ninhidrina.

METODOLOGÍA

SEPARACION DE AMINOACIDOS DE JUGO DE FRUTAS POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL

Se extrajo y centrífugo el jugo de pera a 2000 rpm durante 15 minutos, en un cromatofolio proporcionado por el profesor titular se dividió en partes iguales de 1.0 cm equidistantemente indicando que la cromatografía realizada fue de tipo bidimensional girando a 90 grados la hoja, con un capilar se aplicaron 15 inyecciones continuas del jugo de pera y Valina, Ac Glutámico, Prolina Alanina, Tirosina, se acondicionar la cámara de cromatografía con la segunda fase móvil (Isopropanol: agua en una proporción 50:50) se introdujo el cromatóforo a la cámara cromatográfica, se retiró llegó el eluyente a ¾ partes del cromatofolio, se dejó secar, se reveló rociando ninhidrina al 0.2 % en etanol al 96%  dejando en la oscuridad 1 hora para obtener los valores de Rf.

TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA CAPACIDAD DE INTERCAMBIO DE UN INTERCAMBIADOR IÓNICO

Se utilizó columna empacada con Solución reguladora de Citratos pH 5.25 con ayuda de tubos de vidrio rotulados, se empezó el análisis cromatográfico agregando 1 ml de la mezcla de (prolina e histidina) lo más cerca de la superficie en la parte media superior de la columna abriendo la llave de la columna con un flujo regulado, se recolectó la primera  fracciones de 1 ml agregando solución reguladora de Citratos pH 5.25 sin dejar que la columna se quedará sin FM, se recolectaron 14 fracciones más de 3 ml cada con  solución reguladora de Citratos pH 5.25, al término se cambió la solución por Solución reguladora de citratos pH 2.0 llevando a cabo otras 15 fracciones más, finalmente se leyeron al espectrofotómetro a una absorbancia de 400 nm y 570 nm correspondientes a prolina e histidina.

SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA AZUL DE METILENO Y FLUORESCEÍNA USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN

Se identificaron 7 tubos de ensaye conforme al número de recolección consecutiva colectada, con ayuda de una pipeta Pasteur se introdujo una poción de lana de vidrio, se mezclaron 15 g de Alúmina alcalina a la cual se le adiciono 10 ml de agua hasta que se hidrato la Alúmina, con un soporte universal y unas micro pinzas se mantuvo la columna de vertical fija para empacar la Alúmina en la pipeta Pasteur y colectando el agua en un vaso de precipitados para finalmente, se ajustó a 15 y 20 gotas por minuto, se agregó 0.1 ml de la mezcla de colorantes en la parte central de la superficie de la columna y se inició la recolección de las fracciones de 1 ml por fracción adicionando por 1 ml de agua en la columna hasta que se observó el cambio de color se cambió el eluyente por etanol ácido y se continuó hasta que se observó la pérdida total de colores para finalizar se leyeron al espectrofotómetro para la lectura a 493 nm con agua como blanco de ajuste y 590 nm con etanol agua como blanco de ajuste.

SEPARACIÓN DE GRUPOS USANDO CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN  

Se usó una columna acondicionada con solución reguladora Tris-EDTA y un Gel Sephadex G-25 y un flujo de 12 a 16 gotas por minuto, se midió la altura del lecho cromatográfico y el diámetro del interior de la columna, se roturaron tubos suficientes con numeración consecutiva, se determinó el volumen de vacío (Vo) de la columna adicionando a la misma con una pipeta graduada 0.5 ml de Dextrana Azul 2000, enseguida colectar 15 fracciones hasta visualizar que el color  el color Azul de la Dextrina desapareciera, se leyeron en el   espectrofotómetro a 615 nm usando como blanco de ajuste el primer tubo de la colectado.

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