FOTOSÍNTESIS: EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y MEDIDA DEL DESPRENDIMIENTO FOTOSINTÉTICO DE OXÍGENO

. FOTOSÍNTESIS: EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y MEDIDA DEL DESPRENDIMIENTO FOTOSINTÉTICO DE OXÍGENO

El estudio de los compuestos biológicos implica su extracción y separación del material (célula, tejido, órgano, etc.) en que se encuentren. Uno de los abordajes más utilizados para este propósito consiste en el uso de técnicas de cromatografía (proceso de separación de mezclas complejas mediante particiones entre una fase fluida móvil y una fase estacionaria). Otra técnica es la de separación por reparto entre disolventes inmiscible, que permite separar una mezcla de sustancias en función de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles.

Como aplicación de estas dos técnicas, en el desarrollo de esta práctica se extraerán 4 tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b, carotenos y xantofilas. Todos ellos tienen carácter apolar, qunque su graod de polaridad varía en función de su composición química. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el más apolar al menos apolar.

Esta propiedad permite su separación, y su distinto color su identificación. Su color permite también su cuantificación por técnicas expectrofotométricas.

Finalmente, mediante métodos polarográficos, con la ayuda de un oxímetro (electrodo de oxígeno), se medirá el desprendimiento fotosintético de O2 en un cultivo de cianobacterias (microalgas verde-azuladas).

1.- Separación por reparto en disolventes inmiscibles

Los pigmentos vegetales se extraerán en medio líquido (etanol) con calor, y se separarán utilizando disolventes inmiscibles de distinto grado de polaridad.

Práctica

En las mesas hojas de espinaca, distintos disolventes y embudos de decantación para separar fases inmiscibles.

Método:

1. Extracción: trocear la hoja de espinaca. Introducir los trozos en un tubo de ensayo de calibre grueso y añadir 10 mL de etanol. Taparlo con algodón y calentarlo al baño ‘María’ durante aproximadamente 5 min (retirarlo cuando el etanol adquiera un color verde intenso). Verter el etanol con los pigmentos disueltos en otro tubo de ensayo.

2. Separación:

- Añadir al embudo de cdecantación (con la llave cerrada) 5 mL de gasolina.

- Tomar 5 mL de extracto de pigmentos y añadirlos sobre el embudo de decantación. Se formarán dos fases (A y B)

- Añadir 2 mL de agua (o más, hasta que la fase inferior quede sin pigmentos).

- Desechar la fase inferior (B).

- Añadir en el embudo 3 mL de metanol 92% (v/v). Se formarán dos fases (C y D).

- Recoger ambas fases en sendos tubos de ensayo (usar un tubo de ensayo largo para la fase C)

- Añadir al tubo con la fase C 2 mL de KOH-metanólica 30% (p/v) y agitar bien durante 2 min. Se formarán dos fases (E y F).

Cuestiones:

1. ¿Qué contiene cada una de las fases?¿Por qué esa distribución?

2. ¿Cómo se separarían los pigmentos de la fase D?

2. Cromatografía en papel

Los pigmentos se separarán en base al mismo principio utiolizado en la práctica anterior, con la diferencia de que en este caso, uno de los disolventes utilizados se mueve sobre un soporte sólido (papel).

Práctica

La fase móvil será un disolvente apolar (mezcla de éter de petróleo/acetona/benceno en proporción 85/10/5). La fase estacionaria, de naturaleza polar, será el agua adcorbida en el papel de celulosa utilizado como soporte.

La fase móvil ascenderá por el papel sin mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irán separando en función de su polaridad. Los pigmentos más polares se retendrán más en la fase estacionaria, mientras que los más apolares avanzarán más rápido junto con la fase móvil. La movilidad de cada compuesto respecto al frente del disolvente tiene un valor característico, en unas condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficoente o factor de reparto (Rf).

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