LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE AGUAS Y ALIMENTOS

1. INTRODUCCIÓN

El recuento en placa es el método más utilizado para cuantificar microorganismos viables o unidades formadores de colonias (UFC) en los alimentos. En esta técnica, las porciones de alimento muestreadas se trituran y homogenizan, se diluyen  de forma seriada con un diluyente adecuado, se depositan en una placa en un medio enriquecido en agar y se incuban a la temperatura precisa durante un tiempo determinado.

Este procedimiento puede realizarse sembrando el inóculo en la superficie del medio           (siembra en superficie) o vertiendo y mezclando el inóculo con el agar fundido y esperando que se solidifique (sembrando en profundidad).

Las diluciones se realizan, debido a que la población microbiana en las muestras de alimento varían ampliamente en número, por lo cual si la siembra de hiciera sin diluir, se dificultaría el conteo. Para esto se utilizan las diluciones logarítmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilución, que es el inverso de la dilución.  La dilución inicial siempre será 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parámetros que existan, pero lo importante es que guarde la relación: 1 +9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente.

2.OBJETIVOS

• Preparar correctamente los homogenizados a partir de muestras de alimentos sólidos y líquidos.
• Preparar diluciones logarítmicas en base 10 a partir de los homogenizados.
• Realizar siembra en profundidad, a partir de las diluciones respectivas.
• Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas de recuento.

3.MATERIALES Y EQUIPOS

1. PROCEDIMIENTO

  4.1 Siembra en profundidad

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo.
2. Marcar las cajas de petri y tubos estériles con la fecha, número de grupo, muestra y dilución correspondiente.
3. Desinfectar con alcohol al 70% el empaque que contiene el alimento.
4. Agitar unas 25 veces las muestras líquidas, formando un arco con el antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces. Para las muestras sólidas, pesar 10g de muestra, tratando de tomar porciones de varias partes.
5. Tomar 10mL  o de 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco que contiene 90mL de agua peptonada al 0,1%, mezclar resuspendiendo con la pipeta más de 10 veces o agitar hasta homogenizar la mezcla; así se obtiene la dilución 10-1.
6. Tomar 1mL de la dilución 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 mL de agua peptonada al 0,1% marcado con la dilución 10-2. Mezclar unas diez veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilución 10-2. Realizar las sucesivas diluciones de la misma manera.
7. Tomar las cajas de petri marcadas y agregar 1 mL correspondiente a cada dilución luego de agitar los tubos.
8. Adicionar 15 mL del agar Plate Count fundido a 45°C ± 1 ° C, a cada una de las cajas. Realizar un control de diluyente y un control de medio.
9. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal.
10. Invertir las placas e incubar las cajas durante 48 ± 2 horas a 35 ° C.

 4.2  Siembra en superficie

1. Preparar la muestra  y realizar diferentes diluciones.
2. Marcar las cajas de petri que contienen agar Plate Count con el nombre de alimento, fecha, dilución y N° de grupo.
3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del diluyente y otra como control de medio.
4. Adicionar 0,1 mL de cada una de las diluciones y del control de diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo.
5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre la superficie, hasta que la superficie quede seca.
6. Incubar las cajas durante 48 ± 2 horas a 35°C.

5.BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

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