Tema- Laboratorio Microbiologia.

Resumen Lab. Micro

Microspcopia

1. Brazo – Sostiene el tubo, platina y lenta.
2. Base – De donde descansa el microscopio.
3. Ocular – Magnificacion (X10). Son parafocales (Se puede rotar el objetivo y se mantiene el enfoco). Son paracentrico (centro del campo es el mismo para todos)

Objetivos:

1. 4X, rastreo.
2. 10X, bajo potencia.
3. 40X, alta potencia.
4. 100X, inmersión de aceita

1. Porta objetivo rotatorio – Rota los objetivos.
2. Platina – Sostiene la laminilla.
3. Carro Mecánico – Mueve la laminilla.
4. Botón de ajuste gruesa (Micrométrico) – Mover la distancia entre la platina y el objetivo.
5. Botón de ajuste fina (micrométrico) – Ajustar la platina.
6. Fuente de luz – La bombilla.
7. Diafragma – Regular cantidad de luz por el espécimen.
8. Condensador – Lente localizado sobre el diafragma.
9. Distancia de Trabajo – Distancia entre el espécimen y el lente objetivo.
10. Tipos de microscopios de acuerdo a la fuente de luz

1. Microscopio de luz: utiliza luz visible
2. Microscopio electrónico: utiliza rayos de electrones.

1. En el laboratorio utilizamos Microscopio de Luz Compuesta.

1. Monocular: 1 lente ocular
2. Binocular: 2 lentes oculares

1. Compuesto: microscopio tiene un mínimo de 2 lentes de aumento.

1. Ocular: lente más cerca del ojo.
2. Objetivo: lente que está más cerca del espécimen.

1. 3 Conceptos Básicos de Microscopia

1. Magnificación: factor por cual la imagen es agrandada.
2. Poder de Resolución: capacidad de microscopia de distinguir objetos que están muy cercanos.
3. Contraste: cuan bien se destacan los detalles de la imagen.

Técnica de Gota Colgante

1. Propósito para realizar este procedimiento

• La examinación de microorganismos es útil para observar:

• Actividades celulares: Motilidad y Fusión binaria.
• Tamaño
• Forma
• Expuestas a químicos durante tinciones

1. Materiales: 

1. Agua estancada
2. Anilla
3. Microscopio
4. “Petroleum Jelly” o Vaselina
5. Mechero
6. Cubreobjeto[pic 1]
7. Laminilla
8. Palos de Dientes

1. Movimiento Browniano

• La célula se mueve por el choque de las moléculas de agua.

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de hacer la preparación?

• Se observa invertidamente.

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta manera?

• Para poder ver las células en movimiento.

1. ¿Que razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• Preparación aséptica

1. Muestra usada para hacer la preparación.

-Agua estancada

1. Procedimiento

1. Aplicar el Petroleum Jelly.
2. Técnica aséptica (esterilizar la anilla), luego se pone una gota agua estancada con la anilla en el cubreobjetos.
3. Se pone la laminilla sobe el cubreobjetos y vira.
4. Se observa el cubreobjeto.

1. Heat Fixation - The rapid passage of the smear over the burner flame.
2. How do you distinguish between true motility and Brownian movement?

• La técnica de gota colgante disminuye la velocidad de las moléculas de agua, por lo tanto, en una comparación la motilidad de un microorganismo será mayor a las de las moléculas de agua y nos permite distinguir entre una a la otra.

Transferencia, Cultivo y Características de Microorganismos

1. Cultivo Puro – Contiene solo una especie de célula.
2. Medio de Cultivo – Están vivos, cultivos puros y provee condiciones nutricionales, químicas, físicas y ambientales para que la célula crezca a su máxima expresión.
3. Caldo – Medio de cultivo líquido.
4. Agente Solidifícate – Medio de cultivo que permite mantener consistencia.
5. Agar – Semilíquido suplemento con un agente solidificante. Es un polisacárido complejo, obtenido de algas marinas rojas, particularmente del genero Gelidium. No es digerido por la mayoría de bacterias.  

Gelatina – Químicamente una proteína incompleta.

1. Medio de Cultivo Solido – Tiene una concentración de 1.5% o más agar. Tiene una superficie sólida.
2. Medio de Cultivo Semisólido – Tiene una concentración menos de 1% de agar.
3. Agar Inclinado – Para cultivos puro.
4. Agar Profundo – Usados primariamente para el estudio de requerimientos gaseosos de los microorganismos.
5. Placas Petri – Provee mayor área superficial insolación y estudio de microorganismos.
6. Métodos de Esterilización -  Proceso de representación de un medio o material libre de todas las formas libres de vida.
7. Subcultivar – Se utiliza para preparar y mantener cultivos almacenadas.
8. Incubadora – Para mantener optimas temperaturas durante el periodo de crecimiento. Usan calor seco.
9. Placa Rayada – Método de aislamiento cualitativo.
10. Esparcido en Placa – Requiere una mezcla de microorganismos diluido, las células se extienden en un medio de agar sólido.
11. Vertido en Placa – Requiere una serie de diluciones de un cultivo mixto.
12. Colonia – Representación microscópica de la multiplicación sucesiva de una célula.

Tinción Bacteriana

1. Tinte Biológico – Herramienta para poder estudiar los microorganismos.[pic 2]
2. Cromógena – Compuesto colorido, no es un tinte.  
3. Cromóforo – Grupo químico que le imparte color al beneficio.
4. Auxócromo – Grupo químico que transmite la propiedad de ionización al cromógeno; permiten que forme sales y enlaces a fibras o tejidos.
5. Tinte Básico – Es catiónico (+) porque en la porción de ionización del cromógeno exhibe carga positiva y tiene una afinidad para las células (-). “Azul Metileno”.
6. Tinte Acido – Anionico (-), opuesto de tinte básico.
7. Tinción Simple – El frotis bacterial es manchado con un solo reactivo, que produce contraste entre el organismo y el fondo.
8. Tinción Diferencial – Permite detectar distintas células debido a su coloración.
9. Frotis (Smear) – Preparación de una muestra, para ser observada por diferentes tinciones.
10. Fijación de Calor – Las proteínas de la bacteria se coagulan y arreglan a la superficie del vidrio, para que la preparación no se salga cuando se lave el vidrio.
11. Organismos usados:

1. Micrococous Roseus

Tinción Simple

1. Propósito para realizar este procedimiento.[pic 3]

• Comparar la morfología y arreglos de la bacteria.

1. Materiales

1. Cultivos
2. Mechero
3. Anilla
4. Microscopia
5. Agentes de tinción
6. Bandeja
7. Papel de lente
8. Papel Bibulous
9. Laminillas

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de hacer la laminilla?

• Se observa bajo el ocular de inmersión de aceite.

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta manera?

• El tamaño de las bacterias es tan diminuto que tienen que ser observadas bajo el ocular de inmersión de aceite.

1. ¿Qué razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• Una mal preparación de frotis al igual que contaminando la laminilla de X razón.

1. Microrganismos usados para la preparación.

1. Escherichia Coli
2. Bacillus Cereus
3. Staphylococcus Aureus

1. Aplicaciones de esta técnica

• Determina la figura y cantidad de presencia en la muestra.

1. Procedimiento

1. Se prepara un frotis en una laminilla y luego se tiñe con el tinte designado.
2. Se enjuaga la laminilla con agua de la pluma para remover el exceso de tinte.
3. Se seca la laminilla con papel bibulous.
4. Se observa la muestra bajo la ocular inmersión de aceite.

Tinción Negativa

1. Propósito para realizar este procedimiento.[pic 4]

• Determinar si el organismo posee una capsula.

1. Materiales

1. Machado
2. Anilla
3. Bandeja
4. Microscopio
5. Laminilla

1. ¿Es tinción diferencial o simple?

• Tinción Simple, porque hay un contraste entre la tinción y el organismo.

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de hacer la laminilla?

• Se observa bajo el ocular de inmersión de aceite.

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta manera?

• Se requiere esta magnificación debido al tamaño diminuto del organismo.

1. ¿Qué razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• Contaminar la laminilla o una técnica aséptica mal hecha.

1. Microorganismos usados:

1. Micrococcus Luteus
2. Bacillus Cereus
3. Aquaspirillum IItersonii

1. Usos de esta técnica

• Identificación de hongos como Cryptococcus Neoformans.

1. Procedimiento

1. Se coloca una gota chiquita de la nigrosina a un final de la laminilla.
2. Usando la técnica aséptica, con la anilla se inserta una muestra del organismo en la gota de nigrosina y mezcla.
3. Coloca una laminilla a 45* y riega la muestra hacia la otra esquina de la laminilla.
4. Dejar que se seque la muestra para luego observarla en el ocular de inmersión de aceite.

Tinción Gram

1. Propósito[pic 5]

• Clasifica y diferencia los microorganismos. Los divide en Gram positivo o Gram negativo.

1. ¿Es tinción diferencial o simple?

• Tinción diferencial

1. Agente mordante

• Gram de Yodo

1. Tinte secundario

• Safrina

1. ¿Cómo actúa los reactivos de esta tinción?

• Como un colorante de la célula para poder ser visible.

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de hacer la laminilla?

• Bajo el ocular de inmersión de aceite.

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta manera?

• Para poder ver el organismo debido a su tamaño diminuto.

1. ¿Qué razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• Mal preparación de frotis, sobre decoloración de la muestra o contaminar la muestra.
• Sobre descolonización, las de Gram positivas parecen como las de Gram negativos.
• Baja descolonización, no remueve completamente el cristal violeta y el Gram negativo aparenta como un Gram positivo.

1. Microorganismos usados para hacer la preparación.

1. Escherichia Coli
2. Staphylococcus Aureus
3. Bacillus Cereus

1. Usos de esta técnica

• Indica cuales pruebas se pueden llevar acabo para identificar una bacteria y encontrar un tratamiento para el paciente.

1. Tinte Primario

• Cristal Violeta

1. Agente Decolorante

• Alcohol de Etilo 95%

1. Procedimiento

1. Frotis del organismo indicado.
2. Teñir la muestra con cristal violeta por 1 minuto.
3. Lavar con agua de la pluma.
4. Teñir la muestra con Yodo de Gram por 1 minuto.
5. Lavar con agua de la pluma.
6. Añadir gota a gota el Alcohol Etilo.
7. Lavar con agua de la pluma.
8. Contra teñir con safrina por 45 segundos.
9. Lavar con agua de la pluma.
10. Secar con papel bibulous.

Tinción Acido Resistente (Método de Ziel-Nelson)

1. Propósito para realizar este procedimiento.[pic 6]

• Sirve como una alternativa para visualizar e identificar mejor ciertas bacterias, como las Mycobacterias, en el cual tinción simple y Gram no se puede porque las bacterias son resistentes a tinciones como Gram, llevando acabo resultados falsos.

1. ¿Es tinción diferencial o simple?

• Tinción diferencial

1. Agente Moderante

• N/A

1. Tinte Secundario

• Azul de Metileno

1. ¿Cómo actúan los reactivos de esta tinción?

• Como un colorante en el cual la tinción pasa por la pared de la bacteria hacia el citoplasma para poder teñir la bacteria y poder ser visible.

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de hacer la laminilla?

• Bajo el ocular de inmersión de aceite.

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta manera?

• Para poder ver el organismo debido a su tamaño diminuto.

1. ¿Por qué razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• Un frotis mal hecho, sobre decoloración o contaminación de la muestra.

1. Microorganismos usados para hacer la preparación.

1. Mycobacterium Smegmatis
2. Staphylococcus Aureus

1. Usos de la técnica

• Típicamente se usa para bacterias de la especie Mycobacterium el cual causa tuberculosis y otras infecciones.

1. Tinte Primario

• Carbol Fuchsin (rojo oscuro), 5% fenol el cual lo hace soluble en materiales con lípidos que constituyen gran parte de la pared celular de las Mycobacterias.

1. Agente Decolorante

• Acido-Alcohólico

1. Procedimiento

1. Frotis con la bacteria indicada
2. Se aplica el carbol fuchsin de 5 a 10 minutos.
3. Se lava con agua de la pluma.
4. Se aplica el ácido-alcohólico.
5. Se lava con agua de la pluma.
6. Se aplica el segundo tinte, azul de metileno.
7. Se lava con agua de la pluma.
8. Se seca la muestra con papel bibulous.

1. Mycobacteria

• Tienen una capa cerosa gruesa que complica la penetración del tinte.
• Tienden a juntarse una a la otra aumentando la dificultad para observarlas. El frotis debe ser preparado cuidadosamente.

1. ¿Por qué se llama Acido-Resistente?

• Una vez el tinte haya penetrado, no se puede remover ni con alcohol. Se usan tres agentes diferentes.

1. Metodos

1. Ziehl-Nelson, se usa calor.
2. Kinyoun, modificante del método Ziehl-Nelson que usa calor, pero con un agente que reduce la tensión de la pared celular llamado, Tergitol.

Tinción de Endoespora Bacteria

1. Propósito para realizar este procedimiento[pic 7]

• Diferenciación entre la espora bacteriana y las formas de células vegetativas capsular.

1. ¿Es tinción diferencial o Simple?

• Tinción Diferencial para esporas porque se aplican dos colorantes para distinguir tipos de microorganismos.

1. Agente mordante

• N/A

1. Tinte secundario

• Safranina

1. ¿Cómo actúan los reactivos de esta tinción?

• Actúan como un colorante en el cual se requiere calor para teñir la espora y la célula vegetativa.

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de hacerla?

• Se examina bajo inmersión de aceite

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta forma?

• Porque de esta forma se pueden distinguir las esporas y las células.

1. ¿Qué razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• No llevar acabo correctamente las técnicas asépticas.
• Eliminar todo el tinte cuando se le aplique agua a la laminilla.
• Permitir que se evapore toda el agua que se encuentra dentro del beaker cuando se le esté aplicando calor a la laminilla.

1. Microorganismos usados para hacer la preparación:

1. Bacillus Cereus
2. Clostridium Esporo génesis

1. Usos de la técnica

• Identificar bacterias patogénicas formadas de esporas peligrosas.

1. Tinte primario

• Verde malaquita porque es uno de los pocos tintes que la espora de una capa impermeable acepte. Se requiere calor para que el tinte pueda penetrar.

1. Agente decolorante

• Agua

1. Procedimiento

1. Preparar frotis
2. Anadir verde malaquita y colocar la laminilla encima de un beaker con agua en un Hot plate.
3. Remover la laminilla de encima del beaker, dejar enfriar, y enjuagar con poca agua.
4. Contra teñir con Safranina por 30 segundos.
5. Lavar con poco agua
6. Dejar secar en papel “bibulous” y examinar bajo inmersión de aceite

1. ¿Qué es una endoespora bacteriana?

1. Estructura intracelular que son originadas por el esporo génesis.
2. Activa metabólicamente – Celulas vegetales.
3. No activas metabólicamente – Esporas

1. Sporogenesis – Proceso de formar esporas. Ocurre cuando las condiciones del ambiente se convierten infavorables para que una célula vegetativa realice sus funciones. Normalmente es cuando no tienen la cantidad necesaria de carbonos.
2. Endoespora – Consecuencia de sporogenesis. Es una estructura intracelular, rodeada de capas impermeables llamadas “spore coats”.
3. Free Spore – Resultado de un empeoramiento del ambiente, la endoespora es liberada de la célula vegetativa porque es degradada. No es un método de reproducción, solo mecanismos que aseguran la sobrevivencia de la célula.
4. Niveles de esporas - Tienen una composición química resistentes a un exceso de calor, congelamiento, radiación, desecación y agentes químicos.
5. Germinación – Regreso de condiciones favorables, se revierte la espora a ser metabólicamente activa.

Tinción de Capsula

1. ¿Qué es una capsula bacteriana?[pic 8]

• Capa externa gelatinosa que es secretada por la célula y la rodea y se adhiere a la pared celular.
• Las células que tienen una capsula pesada, son generalmente virulentas y capaces de producir enfermedades, ya que la estructura protege la bacteria de la actividad patogénica de la célula hospedera.
•  La capsula está formada de polisacáridos como lévanos, dextranos y celulosa.
• No todos los organismos la contienen.

1. Usos de la técnica

• Teñir bacterias para detectar si tienen capsula protectora. Las capsulas son solubles en agua y pueden ser removidos con un lavado vigoroso. El frotis no debe ser calentado porque la célula puede encoger y crear una zona transparente siendo parecida a una capsula.

1. Tinte primario

• Cristal violeta

1. Agente decolorante

• Sulfato cuproso

1. Procedimiento

1. Poner varias gotas de cristal violeta en una laminilla limpia.
2. Con técnicas asépticas añadir el cultivo y esparcirlo por la laminilla.
3. Con una laminilla limpia, esparcir la mezcla en la superficie de la laminilla preparada para crear un frotis. Esperar a que se seque la laminilla.
4. Lavar el frotis con la solución de sulfato cuproso. 
5. Examinar bajo inmersión de aceite.

1. ¿Cómo se observa la laminilla después de terminada?

• Se observa bajo inmersión de aceite.

1. ¿Por qué se observa la laminilla de esta forma?

• Porque así se pueden distinguir las capsulas protectoras de las células.

1. ¿Qué razón puede existir para que la preparación no salga correctamente?

• Que no se utilicen correctamente las técnicas asépticas.
• Que no se distribuya correctamente la mezcla en la laminilla.
• Se haga un mal frotis.

1. ¿Microorganismos usados para hacer la preparación?

1. Alcaligenes viscolactis
2. Leuconostoc mesenteroides
3. Enterobacter aerogenes

1. ¿Es tinción diferencial o simple?

• Tinción diferencial

1. Agente mordante

• N/A

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