Laboratorio de Bioquímica General BIOL265

Facultad de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Bioquímica General BIOL265

Trabajo n°1: Determinación de proteínas

Introducción

Las proteínas son macromoléculas de gran importancia debido a que participan en casi todos los procesos que tienen lugar al interior de la célula gracias a una gran variedad de funciones.

Para conocer bioquímicamente la estructura y función de las proteínas se realiza un estudio individual de estas cadenas polipeptídicas. Para estudiar una proteína con cierto detalle debe ser separada del resto de las proteínas, mediante métodos adecuados como la precipitación a causa de cambios en el pH o en la temperatura. (1)

Existen varios métodos para cuantificar las proteínas, los cuales presentan ventajas y sus respectivas desventajas. La selección del método dependerá de la proteína que se busque cuantificar, la sensibilidad que se desea, las interferencias que se pueden encontrar y la simplicidad del método. (2)

1. Método turbidimétrico

Las dos técnicas más utilizadas para determinar las proteínas presentes en el líquido cefalorraquídeo se basan en la producción de turbidez o en la capacidad de unión de las proteínas a un colorante.

El método turbidimétrico consiste en la precipitación de proteínas cuando éstas son mezcladas con ácido tricloroacético, ferricianuro de potasio o ácido sulfosalicílico en ácido acético. (2)

1. Método de absorción ultravioleta

Es un método rápido y simple, el cual requiere de un volumen de muestra pequeño. Se basa en el característico espectro de absorción UV de las proteínas a 280 nm, debido, básicamente, a grupos cromóforos de tirosina y triptófano.

1. Métodos colorimétricos

Método de Biuret: Este método se utiliza para hacer un recuento total de las proteínas en la sangre. Se basa en la formación de moléculas complejas de un color violeta-azul debido a la reacción de las proteínas frente a un medio básico. (3)

Método de Bradford: Se fundamenta en la cuantificación de la unión de un colorante (Coomassie Brilliant Blue G-250) a los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas. Esta unión provoca un aumento en el máximo de absorción del colorante de 465 nm a 595 nm, siendo este último valor el que se controla. (4).

 Objetivos

1. Cuantificar proteínas por el método de Biuret y Bradford.
2. Determinar la concentración de proteínas en una muestra problema.
3. Elaborar una curva de calibración.
4. Aprender a usar de una forma adecuada la micropipeta.

Materiales y métodos

1. Método de Biuret

Este método consiste en un reactivo de sulfato cúprico en medio alcalino, denominado reactivo de Biuret, el cual reacciona con compuestos que contengas dos o más enlaces peptídicos obteniéndose como resultado de esta reacción una coloración violeta. Este color se debe a la formación de un complejo de cobre con los átomos de nitrógeno provenientes de los enlaces peptídicos. Debido a que esta reacción no es totalmente específica para los enlaces peptídicos hay interferencias de otros compuestos como las sales de amonio.

El rango para la valoración de proteínas es de 1 a 10mg.

Materiales:

• Reactivo de Biuret
• Espectrofotómetro
• Muestra de albúmina (10mg/mL)

Procedimiento:

Procedimos a realizar las disoluciones añadiendo agua primero, luego la proteína albúmina y finalmente el reactivo de Biuret en los volúmenes indicados en la tabla a continuación.

Tabla n°1.- Volúmenes añadidos de agua, albúmina y de reactivo correspondientes a cada tubo.

(B) corresponde al blanco del procedimiento y MP a la muestra problema.

1. Método de Bradford

En este método se utiliza el reactivo de Bradford, el cual es un colorante azul, llamado Coomasie G – 250, capaz de unirse a la proteína. Esta propiedad permite determinar la presencia de una proteína ya que, sin asociarse, presenta un máximo de absorción de 465 nm, pero al unirse a una proteína aumenta su máximo de absorción a 595 nm.

El rango para valorar la proteína es de 0 a 30ug.

Materiales:

• Reactivo de Bradford
• Solución patrón de albúmina (100ug/mL)
• Espectrofotómetro

       Procedimiento:

Tabla n°2.- Volúmenes añadidos de agua, albúmina y reactivo de Bradford correspondiente a cada tubo. El tubo 7 corresponde al blanco y MP es la muestra problema.

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