Laboratorio De Bioquimica

LABORATORIO Nº 3

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR MÉTODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS

1. Aspectos teóricos.

En estado de post-absorción la concentración de glucosa sanguínea en el hombre varía entre 70 -110 mg/100mL. La mantención de valores estables de glucosa en la sangre es uno de los mecanismos más finamente regulado. En esta regulación participan el hígado y varias hormonas.

Cuando la glucosa sanguínea alcanza valores relativamente altos, el riñón también ejerce un efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomérulos es habitualmente reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorción de los túbulos renales. La resorción de glucosa está enlazada con el aprovisionamiento de ATP en las células tubulares. La capacidad del sistema tubular para absorber glucosa está limitada a una tasa aproximada de 350 mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser reabsorbida el exceso pasa a la orina produciéndose glucosuria.

En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentración de glucosa en la sangre venosa es superior a 170 – 180 mg/100 mL.

[glucosa]normal en sangre 70 – 110 mg/dL ( 3,9 – 6,1 mmol/L).

[glucosa]normal en orina 1 – 15 mg/dL ( 0,06 – 0,8 mmol/L).

Método cualitativo: tiras colorimétricas.

La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimétricas. Este test usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de D-glucosa a ácido glucónico con formación de H2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el H2O2 generado oxida un cromógeno (orto-dianicidina), produciendo un cambio de color, que indica la presencia de glucosa. Este método es especifico para la glucosa y la detecta cuando su concentración está sobre el rango normal.

Métodos cuantitativos.

Método químico: o-toluidina.

La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehído de la glucosa para formar una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff correspondiente. Las reacciones que tienen lugar después de la condensación original producen una mezcla de cromógenos verdes con una longitud de onda analítica a 630 nm.

Método enzimático: Trinder – 100 (Sigma).

El método enzimático se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa (GOD) por la -D-glucosa. La enzima cataliza la oxidación de la glucosa por oxígeno molecular dando el D-gluconato y peróxido de hidrógeno (H2O2, agua oxigenada) (Rxn. 3.1). Para detectar y cuantificar esta oxidación se ocupa una reacción acoplada (Rxn. 3.2). En forma cuantitativa el H2O2 es oxidado por un reactivo comercial (4-aminofenazona (4-AF) y 4-hidroxibenzoato), reacción catalizada por la enzima peroxidasa, para dar como producto un compuesto coloreado rojo (quinonimina) que se cuantifica midiendo la absorbancia a 505 nm.

Reacción 3.1

Reacción 3.2

2. Objetivos.

Detectar glucosa en una muestra biológica mediante tiras colorimétricas.

Cuantificar glucosa en una muestra mediante un método químico (o-toluidina) y un método enzimático (Trinder-100).

3. Parte experimental.

3.1 Materiales

• espectrofotómetro/ celdas

• trípode/ rejilla / mechero

• baño termostatizado

• cronómetro

• 15 tubos de ensayo

• 2 gradillas

• 2 pipetas graduadas de 1 mL

• 1 pipeta graduada de 5mL

• 1 pipeta graduada de 2 mL

• 1 pizeta

• 1 matraz de aforo de 100 mL

• 1 vaso precipitado de 250 mL

• 1 vaso precipitado de 500 mL

• termómetro

• micropipeta de 20 L, puntas

• tira colorimétrica

3.2 Reactivos

• glucosa 16 mg/dL

• o-toluidina

• glucosa estándar (ensayo enzimático Trinder)

• reactivo de trabajo Trinder-100

4. Procedimiento.

4.1 Tiras colorimétricas.

• Introduzca una tira de prueba en el tubo que contiene la muestra.

• Remueva inmediatamente el exceso de muestra de la tira.

• Espere

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