Las técnicas de cultivo microbiano

INTRODUCCION

Las técnicas de cultivo microbiano sirven para aislar un tipo de microorganismos específicos de una fuente natural, también nos ayuda aumentar el número de población microbiana en condiciones estables entre otras utilidades, para estas técnicas debemos tener algunas cosas clara, tales como el medio de cultivo, los patrones de crecimiento y formas de colonias.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: Agar, Azúcares, Extractos Peptonas, Fluidos corporales, Sistemas amortiguadores, Indicadores de PH, Agentes reductores, Agentes selectivos.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS:

• ™ Por su CONSISTENCIA:

a) Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada).

b) Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.

• Por su COMPOSICIÓN:

a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.

b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.

c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.

d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores físicos y químicos. Entre los factores físicos tenemos la temperatura, el pH y la presión osmótica. Los factores químicos necesarios para el crecimiento bacterial son diversos elementos constitutivos de las células.

• Requisitos Fisicos

o Temperatura El patrón de crecimiento bacterial se ve profundamente influenciado por la temperatura. La temperatura a crecimiento óptimo permite el crecimiento más rápido de las bacterias durante un período de tiempo, usualmente entre 12 y 14 horas. La temperatura mínima de crecimiento es aquella temperatura menor a la cual la especie puede crecer. La Temperatura de crecimiento máximo es la temperatura mayor en la cual el crecimiento es posible. Los microorganismos se dividen en 3 grandes grupos en base a su preferencia de rango de temperatura.

Sicrófilos, son capaces de crecer a 0°C ó menos, pero crecen mejor a una temperatura mayor. Los mesófilos crecen mejor a temperaturas que fluctúan de entre 25°C a 40°C. Aquí encontramos los patógenos de humanos y animales de sangre caliente, éstos crecen mejor a 37°C. Los termófilos son bacterias que crecen a una temperatura óptima sobre los 45°C. La temperatura óptima de crecimiento para estos últimos microorganismos es entre 50 a 60°C.

o pH, En la mayoría de las bacterias el crecimiento óptimo es entre 6.5 y 7.5. Muy pocas bacterias crecen a un pH menor de 4.0. Sin embargo, las bacterias clasificadas como acidófilos son tolerantes a la acidez, un ejemplo es Thiobacillus thiodans que crece a un pH óptimo de entre 2.0 a 3.5.

o Presión osmótica, Los microorganismos requieren agua para su crecimiento, además para obtener nutrientes de ésta. Una presión osmótica alta causa pérdida de agua y plasmólisis de la célula, por lo que se utiliza este fenómeno para conservar los alimentos ya sea añadiendo sal o azúcar, lo que previene el crecimiento bacterial. Sin embargo algunas bacterias se han adaptado a altas concentraciones de sal, a éstas se les conoce como halófilos extremos. Por otro lado, los halófilos facultativos no requieren una alta concentración de sal, pero pueden crecer hasta una concentración de 2%. Otras bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.

• Requisitos Químicos

o Carbóno (C), todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.

o Nitrógeno, azufre y fósforo. Estos elementos se requieren para la síntesis de DNA, RNA, proteínas y ATP.

o Elementos trazas. Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los microorganismos en pequeñas cantidades. Usualmente tienen función de cofactores.

o Oxígen, No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida requieren oxígeno para llevar a cabo respiración aeróbica.

Cuando se hace un cultivo debemos tener en cuenta que las cajas de Petri deben estar en posición invertida para evitar que el agua proveniente del metabolismo bacteriano caiga sobre la colonia y modifique la forma de la colonia; además de que encubar los cultivos ayuda a mantenerlos y hacer que estos crezcan, ya que la incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo.

OBJETIVOS

METERIALES

• Cajas de Petri

• Agar nutritivo

• Caldo nutritivo

• Azas bacteriológicas

• Vinipel

• Mechero

• Hisopos

• Cristal violeta

• Azul de lacto fenol

• Agua destilada

• Guantes

• Cinta trasparente

• Microscopio óptico

METODOS

En la primera sesión de este laboratorio se utilizaron dos medios de cultivo el primero agar nutritivo, en cuál se extendió una muestra tomada del interior de la mejilla esta se selló con Vinipel y se almaceno en una nevera durante 48 horas a 37ºC para luego de éste tiempo colocar en la incubadora del laboratorio; y el segundo PDA (agar papa dextrosa), en el cual se extendió una muestra de una planta que se encontraba adherida al tronco de un árbol la cuál fue previamente picada, para evitar que el cultivo se contaminara con otras bacterias, se selló con Vinipel, se rotulo y se tuvo durante 8 días a temperatura ambiente manteniéndola alejada de la humedad y la luz solar, posteriormente se trajo y se colocó en la incubadora del laboratorio.

En la segunda sesión, se observaron los cultivos de microorganismos a través del microscopio óptico, para ello se procedió de la siguiente manera:

Identificación de bacterias:

• se identifican las colonias de bacterias mesófitas (llamadas así porque permanecieron a 37ºC).

• En un portaobjetos que contiene una gota de agua destilada se deposita una muestra del medio de cultivo que contiene agar nutritivo extendiéndola en forma circular, dicha muestra se debe tomar con el aza bacteriana. Luego se debe flamear la muestra para que el calor ayude a fijar la muestra, esto se hace con ayuda del mechero en forma horizontal de manera rápida para evitar que el calor rompa el portaobjetos, para finalizar se procede a agregar cristal violeta, se deja durante 3 minutos y luego se lava el exceso de colorante con agua destilada, se escurre y se vuelve a flamear para secar la muestra, posteriormente se inician las observaciones en objetivo de 40x y 100x sobre los tipos de bacterias.

Identificación de hongos

• Se identifican las colonias y se decide de que parte se va a realizar la muestra, luego se corta un pedacito de cinta transparente y se toca de manera suave la colonia que se eligió para la muestra, posteriormente se pega la cinta en un portaobjetos que contiene una gota de lactofenol y para finalizar se realizan las observaciones en el microscopio en 40x para identificar las estructuras de los hongos.

OBSERVACIONES

OBSERVACION DE BACTERIAS

Muestra tomada de la mejilla interna Cultivo de bacterias

Visualmente en éste cultivo encontramos 39 colonias y al observar a través del microscopio en objetivo de 40x y 100x notamos que están clasificadas así:

Tamaño: encontramos 1 grande, 18 medianas y 20 pequeñas, basadas en las diferencias relativas entre las colonias vistas.

Forma y margen: pudimos observar que las pequeñas son puntiformes, en las medianas 15 son circulares y 3 son irregulares, y la colonia grande tiene una forma irregular.

Elevación: acá las pequeñas eran planas, las medianas eran elevadas y la grande era embónate.

Consistencia: suave

Color: las pequeñas eran de color blanco nieve, y las medianas eran de color amarillo Nápoles claro, y la grande era blanca nieve con un punto de color sepia en el centro

Determine y anote la identidad de sus colonias

Pudimos observar en el objetivo de 40x y 100x que en su gran mayoría eran cocos y diplococos, pero además eran evidentes también algunos vibriones (diplobacilos), bacilos y estafilococos

OBSERVACION DE HONGOS

Muestra tomada de una planta adherida a un árbol

Visualmente era notorio que nuestro cultivo se encontraba poblado de hongos y además observamos a través del microscopio en objetivo de 40x y encontramos características como:

Tamaño: En éste cultivo observamos variedad de tamaños debido a esto era difícil observar los tamaños ya que habían algunas que recubrían a las más pequeñas, sin embargo a simple vista habían 10 pequeñas, 3 medianas y 6 grandes, basadas en lo observado.

y de colores unos eran muy pequeños

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