Lisogenia Y Conjugación Bacterial (Traducción De Un Paper En Inglés)

Lisogenia y conjugación bacteriana

El laboratorio de Andre Lwoff era atravesado por un largo corredor donde todos se conocerían para discusiones sin fin sobre experimentos e hipótesis. En uno de los finales del corredor el grupo de Jacques Monod estaba agregando b-galactosa a cultivos bacteriales para iniciar la biosíntesis de b- galactosidasa; en el otro extremo, Andre Lwoff y sus colaboradores estaban empapando cultivos de bacterias lisogenicas con luz ultravioleta habiendo descubierto los medios para iniciar la biosíntesis del bacteriófago. Ambos estaban por lo tanto induciendo a su manera, convencidos que los dos fenómenos no tenían algo en común.

Habiendo llegado a preparar una tesis doctoral con Andre Lwoff, me asignaron el estudio de lisogenia en Pseudomonas pyocyanea. Aunque yo conscientemente me prepare para irradiar este organismo. Sin embargo, no tardo en hacerse aparente que el problema de la lisogenia era primariamente que la relación entre bacterias y bacteriófagos, en otras palabras un asunto de genética.

La genética de bacterias y bacteriófagos había nacido diez años antes, con un paper de Luria y Delbrück. Esto continuo creciendo con las investigaciones de Lederberg y tatum, Delbriick y Bailey, han Hershey.

Pero esta joven ciencia ya había producido muchas sorpresas para biólogos. Lo mas importante fue la demostración por Avery, MacLeod, y McCarty, y mas tarde Hershey y Chase, de que la especificidad genética es llevada por el ADN. Por primera vez se hizo posible el dar algunos significados químicos y físicos a los conceptos biológicos viejos de herencia, variación, y evolución. Una interpretación molecular de este estilo de los fenómenos genéticos es exactamente lo que fue provisto en la estructura del ADN propuesta por Watson y Crick.

Otra sorpresa fue la realización de su ritmo de crecimiento rápido, su habilidad para adaptarse a muchos medios diferentes y la variedad de sus mecanismos de transferencia genética hacen a las bacterias y los virus objetos de elección para estudiar las funciones y la reproducción de las células.

El trabajo de Beadrle y Tatum, Lederberg y Benzer ha mostrado que con un poquito de imaginación uno puede ejercer en una población de microrganismos la suficiente presión selectiva como para aislar, casi a voluntad individuos en los que una función particular fue alterada por mutación. En efecto una de las formas más efectivas de determinar los mecanismos normales de las células es explorar anormalidades en mutantes seleccionados adecuadamente.

Los primeros intentos para analizar la lisogenia genéticamente tenían la intención de determinar la localización del profago en la célula bacteriana, fueron llevados a cabo en 1952 por E. y J. Lederberg y por Wollman. Ciertas cruzas entre las bacterias lisogenicas y las no lisogenicas sugirieron algún vínculo entre el profago lisogenico determinado por el carácter λ de Escherichia Coli y otros caracteres controlados por genes bacteriales. De todas formas otras cruzas dieron resultados anómalos. De hecho, la respuesta obtenida de estos experimentos difícilmente podría ser decisiva desde que el mecanismo de la conjugación no era entendido para ese entonces.

Fue con la intención de continuar este estudio, bajo algunas condiciones diferentes, que empecé a trabajar con Elie Wollman; muy pronto nuestra colaboración se convirtió en una particularmente cercana y amistosa. Nosotros queríamos, en primer lugar, entender las anomalías observadas en las cruzas entre bacterias lisogenicas y no lisogénicas. En particular el hecho de que el carácter lisogénico no era transmitido a recombinantes excepto cuando era portado por una bacteria femenina. Para estudiar este problema nosotros usamos una bacteria masculina mutante recientemente aislada por William Hayes y llamada Hfr, ya que en cruzas con bacterias femeninas producían recombinaciones con frecuencia alta. Cruzando estas bacterias lisogenicas masculinas (Hfr) con bacterias no lisogénicas femeninas nos sorprendimos de encontrar que las zigotas formadas por mas de la mitad de las células masculinas ocurrieron en lisis y producción de fago. Este fenómeno, denominado como inducción zigotica mostro que el equilibrio entre el profago y la bacteria es mantenido por algún sistema regulador presente en el citoplasma de una bacteria lisogenica pero ausente en una no lisogenica.

Por otra parte, esto mostro que un carácter genético transferido por la bacteria masculina puede ser expresado en la zigota sin ser integrado en el cromosoma de la bacteria femenina. Por lo tanto pudo ser posible en la conjugación bacterial distinguir experimentalmente entre transferencia de un material genético y evento de recombinación.

En orden de llevar el análisis de la conjugación del nivel de población al nivel de par bacterial individual tuvimos que entender como el material genético del macho es transferido a la hembra. En particular, uno podría tratar de interrumpir la conjugación después de varios tiempos para encontrar cuando la transferencia tiene lugar. Elie Wollman tubo la idea inicial de interrumpir la conjugación plantando colocando una mezcla de apareamiento en una de esas licuadoras que ordinariamente se encuentra en las cocinas. Resulto que las fuerzas de cizallamiento generadas en la licuadora separaban los machos de las hembras; el cromosoma macho es destruido durante el transito pero el fragmento de cromosoma que ya ha penetrado a la hembra puede expresar sus potencialidades y someterse a la recombinación. De esta forma podría demostrarse que después del emparejamiento el macho lentamente inyecta su cromosoma en la hembra. Esta inyección sigue una programación estricta y, sin ninguna presión en particular, la inyección siempre empieza en el mismo punto.

Con este sistema, se hizo relativamente fácil de analizar la constitución genética de E. coli, para mostrar que los caracteres bacterianos están dispuestos en un solo grupo de ligamiento, denominado el cromosoma bacteriano, y para asignar, no sólo por los métodos clásicos genéticos, sino también por mediciones físicas y químicas.

Por otra parte dos nuevos puntos de vista emergieron de este estudio. Primero, el cromosoma bacterial resulto ser una estructura cerrada o circular. Segundo, no era una unidad arreglada como uno podría llegar a creer: otros elementos genéticos, denominados episomas (por ejemplo un cromosoma fago o un factor sexual) puede ser agregado a, o sustraído de. Estas propiedades resultaron ser de gran valor en estudios subsecuentes de las células bacterial y su funcionamiento.

Expresión del material genético: el mensajero

En adhesión a su interés por el análisis de los fenómenos estrictamente genéticos la conjugación bacterial particularmente probó adaptarse bien para el análisis de las funciones celulares ya que proporcionan un medio de transferencia a una población entera un gen dado en un tiempo dado. Los efectos fenotípicos producidos por la apariencia repentina de un nuevo gen en la bacteria recipiente son manifestados luego sin complicaciones acompañantes que ocurren en organismos más altos como resultado de la morfogénesis o la diferenciación celular.

Al final de este corredor Jacques Monod ha llegado a la conclusión de que mas progresos en el entendimiento de la inducción enzimática requerían análisis genéticos. Dos tipos de mutaciones, que afectaron la biosíntesis inducida de B-galactosidasa, eran conocidas en ese tiempo. Un tipo abolió la capacidad de producir una proteína activa. El otro cambio es el carácter inducible de las síntesis enzimática así esta se convertiría en constitutivo. Esto es, capaz de proceder aun en la ausencia de un inductor de b-galactosido. ¿Como son expresados estos genes? ¿Cual es la relación entre los determinantes genéticos revelados por estas mutaciones? ¿De donde resultan los caracteres inducibles y constitutivos?

Muchas de estas preguntas pueden ser experimentalmente abordadas a través de la conjugación bacteriana. Mediante el uso de las bacterias masculinas y femeninas de los genotipos aptos, se podría transferir el alelo deseado de un determinado gen en una bacteria, y luego estudiar la condición de síntesis de las enzimas en el cigoto.

Tales experimentos fueron llevados a cabo con la colaboración de Arthur Pardee, quien había venido a pasar el año al Instituto Pasteur. Ellos llegaron a dos conclusiones. La primera fue relevante para el mecanismo de inducción en sí. Transferir a una bacteria constitutiva del determinante genético para inductividad de la enzima por b-galactosido resultó en la formación de diploides transitorios, heterozigos para los caracteres “inducible/consitutiva”. Obviamente, el fenotipo de tales zigotas debió permitir una chance de entre las diferentes hipótesis expuestas en ese entonces para explicar la inducción. Los experimentos mostraron que el alelo “Inducible” puede expresarse a su mismo independientemente del gen que controla la síntesis de la enzima; y ese es el dominante por encima del alelo “consitutivo”. Este resultado reveló la existencia de un gen especial que controla la inducción formando un producto citoplasmático que inhibe la síntesis de la enzima en ausencia de inductor. Como veremos más adelante, este descubrimiento cambio las nociones existentes sobre los mecanismos de inducción e hizo posible un análisis genético de los sistemas que regulan los radios de síntesis proteínicas.

La segunda observación tuvo que ver con el funcionamiento del material genético. Transfiriendo el gen que gobierna la estructura de una proteína a una bacteria que no lo tiene uno puede determinar las condiciones bajo las cuales este

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