Manual de bioquimica metabolica Universidad de Sonora

Universidad de Sonora

Unidad Regional Sur

Departamento de Ciencias Químico Biológicas

y Agropecuarias

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Prácticas de Laboratorio

de Bioquímica Metabólica

Q.F.B. Eva Irma Vejar Rivera

INDICE

PRACTICA No. 1

OBTENCION DE ATP DEL MUSCULO DE CONEJO

INTRODUCCION

        Los derivados fosforilados, juegan un papel muy importante en las transferencias energéticas de los organismos vivos. La unidad básica de energía en toda escala filogenética de seres vivos es la Adenosina Trifosfato, comúnmente conocida como ATP.

        La importancia de los fosfatos orgánicos en el metabolismo fue escrita por Harden y Young en sus estudios de fermentación, que tuvieron como consecuencia el aislamiento de metabolitos como glucosa- 6- fosfato, fructosa -6- fosfato, fructosa 1,6- difosfato. Embden, Mayerhoff, Parmas y Cori señalaron que estos metabolitos también eran intermediarios en el metabolismo del glucógeno y de la glucosa en el músculo y otros tejidos. Fiske y Subbarow y Engleton  descubrieron la creatina- fosfato en el músculo de los vertebrados, Meyerhoff y Ruranyi encontraron que la rotura enzimática de la creatina-fosfato liberaba mucha energía. Lundsgaard mostró que la energía producida en la contracción muscular era aproximadamente equivalente a la energía liberada en la ruptura de la creatina-fosfato.

En 1931 Lohmann aisló por primera vez el ATP a partir del músculo. Originalmente lo llamó “adenilpirofosfato”, y encontró que se obtenía mucha energía cuando se hidrolizaban los grupos fosfato terminales del ATP.

Meyerhoff pudo preparar extractos de músculo en solución isotónica fría de cloruro de potasio, y que contenía todo el sistema enzimático para romper el glucógeno rápidamente a ácido láctico, y también para romper la creatina fosfato y el ATP. Lohmann entonces demostró que la descomposición del ATP precede a la rotura de la creatina fosfato y que la rotura de ésta se debe no a la hidrólisis sino a la reacción con el ADP formado en la descomposición del ATP. Esta reacción es reversible y se conoce como la reacción de Lohmann. De estos estudios se dedujo que el ATP y no la creatina proporcionan directamente la energía para la contracción muscular.

FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA

El método que sugerimos en esta práctica es una modificación y simplificación del método descrito por Louis Berger. El método original es el método propuesto por Lohmann, Shuster y Kerr. El ATP preferencialmente se obtiene del músculo de conejo. El conejo se anestesia con sulfato de magnesio al 51%. Luego se sacrifica al animal y se separa todo el músculo posible. Entonces el ATP se extrae con ácido tricloroacético. Se sigue luego una serie de precipitaciones del ATP como sal de bario y de mercurio. La sal de mercurio se descompone con H2S y se vuelve a precipitar como sal de bario. Mientras mas precipitaciones se hagan mayor será la pureza del ATP que se obtiene. Después de cuatro precipitaciones se llega a obtener de 90 a 95 %  siendo la mayor impureza la sal da bario del ADP.

En condiciones óptimas se obtiene un rendimiento de 2 a 3 gramos de la sal de bario del ATP por cada kilogramo de músculo. Como de un conejo normal salen unos 500 gramos de músculo, nuestro rendimiento en la práctica debe de ser de 1 a 1.5 gramos de ATP.

Si se dispone de espectrofotómetro de ultravioleta se puede al final sacar el espectro de absorción para confirmar que es ATP. También se puede hacer la reacción de Bial, que debe de dar positiva por la presencia de la ribosa, siendo esto una confirmación de lo que se ha obtenido es ATP.

MATERIAL NECESARIO

Primera parte:

Jeringa de 5 o 10 ml.

Cuchillo filoso o bisturí

Tijeras o navaja

Lienzo para filtrar (pañuelo o tapaboca)

Cuba para hielo

Erlenmeyer Kitasato con manguera y embudo Buchner de 10 cm. de diámetro

3 vasos de precipitado de 500 ml.

4 matraces erlenmeyer de 500 ml

4 embudos de vidrio

1 balanza granataria

2 probetas de 100 ml

1 pipeta de 5 ml

1 pipeta de 10 ml

1 dosificador

Guantes de hule

Licuadora

Gran cantidad de Papel filtro

Hielo

Bomba para vacío

Segunda parte:

4 vasos de precipitado de 500 ml.

2 vasos de precipitado de 250ml.

4 erlenmeyer de 1000 ml.

4 embudos de vidrio

16 tubos de centrifuga de 13x100

Tubo de ensaye grande con tapón agujerado.

Tubo de vidrio 25 cm.

Gradilla

Hielo

Centrífuga

Papel filtro

Tercera parte:

Cuba para hielo

6 tubos de ensaye de 13x100

2 vasos de precipitado de 100ml

2 vasos de precipitado de 50 ml

2 matraces de 1000 ml

Embudo

Gradilla

Hielo

PROCEDIMIENTO

PRIMERA PARTE

A.- ANESTESIA DEL CONEJO

1. Inyecte el conejo por vía intraperitoneal con 1.0 ml de sulfato de magnesio pentahidratado al 51% por kilo del conejo, y déjelo libre.
2. Si a los 10 minutos el conejo no se ha anestesiado, inyéctele nuevamente sulfato de magnesio,  esta vez 0.5 ml. por kilo de peso, y así sucesivamente, cada 10 minutos hasta que el animal no de reflejo ocular (puede llevarse hasta media hora).

B.- OBTENCION DEL MÚSCULO

1. Decapite al conejo (córtele la yugular, y deje que se desangre lo mejor posible.
2. Inmediatamente, y trabajando con la mayor rapidez, proceda a despellejarlo. (entre varios se puede organizar el trabajo y terminar el trabajo más rápido). Para esto, lo mejor es con tijeras y navaja filosa hacer un corte circular en la piel de cada pata trasera, y continuar el corte por la parte inferior de las patas. Se separa la piel  tirando de ella  con fuerza hacia la cabeza.
3. Quite todo lo más que pueda de músculo de las patas traseras y del lomo, póngalo en un vaso de precipitado de 500 ml. pesado de antemano y sumergido con tiempo en el hielo. Pese el músculo total que obtuvo. Tiene que obtener un mínimo de 500 gramos.
4. Corte el músculo con tijeras o navaja. En fragmentos muy pequeños, procurando que el músculo este lo menos tiempo posible fuera del hielo.

C.- EXTRACCIÓN DEL ATP

1. Triture el músculo en la licuadora, cuidando que el vaso de la licuadora haya estado en el refrigerador unos 15 minutos. Se debe triturar en pequeñas porciones, cada vez con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10 % frío. no introduzca los 500 gramos a la vez. Hágalo en porciones de 50 a 100 gramos cada vez, con 50 o 100 ml. de tricloroacético. Con un minuto de trituración, u homogenización para cada porción, es suficiente. Filtre el extracto a través de un lienzo o pañuelo. Si es necesario exprima manualmente para extraer el liquido, pero use guantes para que el tricloroacético no toque la piel, pues la quema.
2. Trate el residuo nuevamente con un volumen igual de tricloroacetico al 5% en la licuadora, de la misma manera que se hizo antes. Filtre y combine los filtrados.
3. Filtre los extractos combinados a través de buchner con vacío. Se debe obtener un filtrado claro. Vuelva a filtrar si es necesario. Se puede filtrar con embudo de vidrio, se puede obtener mejor filtrado.
4. Añada unas 5 gotas de azul de bromotimol y titule hasta pH 6.8 (color verde), añadiendo hidróxido de sodio al 40 % (se requieren unos 40 ml. de NaOH por cada litro de extracto).

D.- PRIMERA PRECIPITACION COMO SAL  DE BARIO

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