Cuantificacion de proteínas totales
Enviado por valentino123 • 28 de Febrero de 2016 • Prácticas o problemas • 1.674 Palabras (7 Páginas) • 421 Visitas
PRACTICA N° 6
CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES
FUNDAMENTO DEL METODO ESPECTROFOTOMETRICO
En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia química.
La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.
Ley de Beer
La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución.
Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado sería mayor que si repitiéramos esto en el segundo, ya que en este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.
Ley de Lambert
La Ley de Lambert dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz.
Según la ley de Lambert, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo, ya que en este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos, tal como se explicó en la ley de Beer.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley de Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo una combinación de las citadas anteriormente.
Transmitancia y absorción de las radiaciones.
BASE TEORICA
Las proteínas son macromoléculas compuestas por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. La mayoría también contienen azufre y fósforo. Las mismas están formadas por la unión de varios aminoácidos, unidos mediante enlaces peptídicos. El orden y disposición de los aminoácidos en una proteína depende del código genético, ADN, de la persona.
Las proteínas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no existe proceso biológico alguno que no dependa de la participación de este tipo de sustancias.
FUNDAMENTO
El procedimiento de proteínas es una modificación de la reacción de Biuret descrito originalmente por Kingsley. Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio alcalino se compleja con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxigeno de los enlaces de todas las proteínas.
La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas y es medida espectrofotométricamente a 540 nm.
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
- Reactivo de EDTA/Cu
- Suero patrón: Solución de albumina y globulinas en estado nativo con título conocido de proteínas.
- Muestra Biológica: Suero sanguíneo libre de hemolisis
- Agua destilada
- Espectrofotómetro o foto colorímetro
- Pipetas
- Baño isotérmico
- Tubos de ensayo
PROCEDIMIENTO
Utilizar 5 tubos de ensayo y colocar en cada uno de ellos, como se indica en el siguiente cuadro:
Reactivos(uL) | Blanco | Tubo 1 | Tubo 2 | Tubo 3 | Problema |
H2O(d) | 100 | 75 | 50 | 25 | 50 |
Sol. Estándar | - | 25 | 50 | 75 | - |
Muestra Biológica | - | - | - | - | 50 |
Biuret(mL) | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Mezclar e incubar por 15 minutos a 37°C. Leer en espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm llevando a cero con el blanco.
CALCULOS
1dl 4,5gr[pic 1]
25ul X1[pic 2]
X1 = 1,2 mg
1000000ul 4,5gr[pic 3]
50ul X2[pic 4]
X2 = 2,4 mg
1000000ul 4,5gr[pic 5]
75ul X3[pic 6]
X3 = 3,6 mg
ABSORVANCIAS (nm)
St1 = 0,1731
St2 = 0,2769
St3 = 0,3135
Muestra = 0,4032
PRECAUSIONES
Los reactivos no pipetear con la boca, son tóxicos.
RECOMENDACIONES
Usar suero sanguíneo el plasma puede ser usado pero se obtienen valores ligeramente altos debido al fibrinógeno. Muestras hemolizadas no se deben usar.
Anote el estado ambulatorio o encamado del paciente. Las proteinas totales de un paciente ambulatorio será de 0.5 g/dl más grande que el paciente encamado.
Sustancias que interfieren
La hemolisis debe evitarse. El color producido por 1 mg de hemoglobina es equivalente a 1.9 de proteínas séricas. En las muestras lipenicas y control lipofilizado deberá usarse blanco. Bromosulfoftaleina puede dar falsos resultados altos. Valores de bilirrubinas menores de 25 mg/dl no intervienen.
CUESTIONARIO
1.- Con los datos de Absorbancia y concentración de los estándares, grafique la curva del patrón o curva de calibración indicando sus parámetros.
[pic 7][pic 8][pic 9]
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