Microscopia Confocal

Introducción

La microscopía láser confocal es una técnica de observación con excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia. El éxito de ésta se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones ópticas" de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional sin dañarla. Además de estudios de células “in vivo”, permitiendo observar su comportamiento y los procesos que éstas llevan a cabo como por ejemplo la reproducción celular. Desde que Zacharias Jensen inventara el primer microscopio compuesto a finales del siglo XVI muchos avances se han logrado en la microscopía. Unos de los problemas más significativos en cuanto a la resolución solía ser que las partes de las muestras que estuvieran fuera del punto focal, emitían sombras y generaban una imagen borrosa. Aparte, muestras gruesas que no tuvieran la cualidad de la transparencia no podían ser analizadas. Marvin Lee Minsky en 1957 patenta un microscopio que solucionó este problema estudiando el Sistema Nervioso; pensó que si él pudiera verlo en sus diferentes niveles podría entender cómo funcionaban los circuitos neuronales, entonces fue así como desarrolló el microscopio de barrido por etapas, de doble enfoque; hoy conocido como el “microscopio confocal”.

Fundamentos

El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores. La microscopía confocal permite obtener secciones ópticas en profundidad que generan imágenes tridimensionales de la morfología de una muestra. La imagen se forma punto a punto cuando el láser incide en diferentes secciones de ésta. La utilización de un láser como fuente de luz permite focalizar la iluminación en una región muy pequeña de la muestra y con una gran intensidad.

Descripción de un microscopio confocal

• Base: Estructura que brinda soporte y estabilidad al microscopio.

• Oculares: Lentes que permiten observar la muestra analizada en él.

• Objetivos: Lente situada cerca de la muestra que amplía la imagen de ésta.

• Diafragma: Sistema que regula el paso de luz hacia la muestra. La apertura de éste depende de la intensidad de fluorescencia. Entre menos sea la intensidad de fluorescencia, se necesitará una mayor apertura del diafragma.

• Diafragma de Alfiler o Pinhole: El primer diafragma se encuentra entre la fuente de luz y el objetivo y el segundo entre el objetivo y el detector. Ambos deben estar alineados de forma que el segundo de ellos únicamente deje llegar al detector luz procedente del plano focal.

• Diafragma Detector Espectral: Permite seleccionar la luz del plano focal.

• Cabeza de exploración confocal: Caja ubicada en la cima del microscopio donde se localizan los scanning mirrors (espejos de escaneo) cuya función es mover los láseres y el pinhole.

• Cables de fibra óptica: cables que transmiten la información y la luz de los láseres.

• Laser launcher: artefacto que contiene los láseres que se ocuparán para iluminar la muestra.

• Laser combiner: después de que el launcher envía la luz de sus láseres, este aparato los combina y los envía a la cabeza de exploración confocal.

• Ordenadores: reciben la información de los detectores y muestran las imágenes en los monitores, existen varios tipos de software que permiten reconstruir imágenes en 3D.

• Scanning mirrors: Se utilizan para mover el láser alrededor de la muestra, para escanear diferentes puntos de ella.

• Espejo dicroico: Está configurado de modo que refleje el haz de láser y transmita la emisión de luz que procede de la muestra. Además estos espejos recorren toda la muestra vibrando y eliminan el problema de los diseños de sistemas.

• Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos, barreras con agujero de diámetro variable (pinhole) y diversos filtros de excitación (para seleccionar la longitud de onda de excitación del fluorocromo).

• Detectores: Son instrumentos muy sensibles a la fluorescencia emitida (Fotomultiplicadores) que amplifican la señal emitida por la muestra. Para los microscopios de disco giratorio, se usan cámaras CCD (charge-coupled device) para la captura de información.

• Procesamiento de imagen: Se requiere una computadora suficiente memoria y procesamiento de alta resolución complementada con software de captura y análisis de imágenes, así como impresoras de muy alta calidad.

• Láser: Puede ser: Argon (458, 476, 488, 496 y 514nm), Helio-Neón (543nm), Helio-Neón (633nm), Diodo azul (405 nm).

• Filtro óptico: Permite seleccionar la línea o líneas de emisión e intensidad del láser que mejor se ajusten al espectro de excitación de los fluorocromos que tenemos en la muestra. Este filtro permite también regular la intensidad del láser. A mayor intensidad del láser tendremos mayor emisión de fluorescencia, pero también se nos producirá un mayor

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