PRÁCTICA No. 6: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

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PRÁCTICA No. 6: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

Elaborado por: MSc. Katherine Apunte Revisado por: PhD. Carolina Proaño

OBJETIVOS:

• Determinar la calidad microbiológica de un alimento mediante el conteo de aerobios totales y coliformes totales.

• Familiarizarse con la metodología del recuento de microorganismos.

INTRODUCCIÓN:

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Uno de los aspectos importantes que la industria de alimentos debe vigilar es la inocuidad de sus productos. Según la Organización Panamericana de la Salud la inocuidad de un alimento es garantizar que el mismo no causará daño al consumidor cuando este sea preparado o ingerido de acuerdo con el uso que se destine.

Estos procesos de vigilancia previenen las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) y por ello es imprescindible evaluar la calidad de un producto en términos de la carga de microorganismos que posee. El hecho de que ciertos grupos de microorganismos se encuentren presentes en los alimentos no necesariamente es un indicativo de un riesgo para la salud. Está descrito que los microorganismos están presentes en plantas y animales, por tanto, es comprensible que los alimentos que básicamente provienen de estas fuentes o de sus derivados contengan también microorganismos. Sin embargo, cuantificar la carga microbiana e investigar la presencia de microorganismos patógenos son fundamentales para establecer la calidad sanitaria de un alimento.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Una de las estrategias utilizadas para ello es el recuento de microorganismos en placa que se utiliza como indicador de la calidad de un alimento o predice el tiempo de vida útil del mismo. Esta metodología basa en el principio de que cada célula viable crecerá y se multiplicará hasta formar una colonia (UFC), de tal modo que el número de colonias en la placa es el reflejo del número de células viables presentes en la muestra.

En ese sentido, es necesario considerar que los microorganismos no se encuentran distribuidos de forma homogénea en la muestra y por ello es necesario tomar varias muestras de un mismo alimento para establecer su calidad microbiológica. No obstante, en algunos casos esto no es posible por lo que es necesario tomar una muestra representativa con la ayuda de instrumentos estériles para no alterar la carga microbiológica por causa de una contaminación. Si la muestra debe ser transportada, estas deben mantener la cadena de frío a 4°C hasta su procesamiento que debe ejecutarse dentro de las primeras 24 horas desde la toma de muestra. Por otro lado, si la muestra es congelada esta debe mantenerse congelada hasta su análisis.

Este recuento se debe realizar en un medio que favorece el crecimiento de la mayoría de microorganismos, por lo que generalmente se utiliza agar nutritivo. De igual manera el recuento en placa se puede ejecutar utilizando 2 técnicas: vertido en placa o extensión en placa. En la técnica de extensión en placa, sobre la superficie de una placa con agar se toma un volumen de 0,1 mL de un cultivo diluido y se extiende la muestra con ayuda de un asa de Drigalsky. En la técnica de vertido en placa se toma un volumen entre 0,1 a 1,0 mL de cultivo en una placa estéril, y a continuación se añade agar nutritivo justo a la temperatura por encima del punto de solidificación y se mezcla con cuidado moviendo suavemente la placa.

DILUCIONES SERIADAS

Para el análisis y recuento en placa primero se hacen diluciones en serie para conseguir una concentración adecuada que permita sembrar y conseguir colonias que puedan contarse. Para hacer una dilución seriada hasta 10-6 generalmente se mezcla 1 mL de muestra en 9 mL de cultivo líquido, y a partir de esta dilución se transfiere 1 mL de la dilución en un tubo nuevo con 9 mL de medio líquido de forma sucesiva 5 veces hasta completar 6 diluciones como se observa en la figura 1.

Posteriormente se toma un volumen de cada dilución (entre 0,1 – 1 mL) y se transfiere a una placa con agar nutritivo y se extiende con la ayuda de un asa de Drigalsky y se incuba.

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GUÍA PARA EL RECUENTO DE COLONIAS

Después de la incubación, las colonias que han crecido en cada caja petri deben ser contadas de acuerdo al siguiente método, el cual ha sido adaptado del libro “The Compedium of Methods for the Microbiological Examinatin of Foods”. El propósito de esta guía es asegurar la reproducibilidad de resultados entre diferentes microbiólogos y laboratorios.

1. Cualquier colonia que esté físicamente distinguible se cuenta como una: Las colonias de algunas bacterias pueden ser de forma irregular y por esto es difícil cuantificar las colonias. Este conteo puede ser interpretado de diferente manera por cada investigador. Para estandarizar el conteo, cualquier colonia distinguible se cuenta como una. Se debe asegurar que todas las colonias sean contadas incluidas aquellas colonias que resaltan. Un aparato para conteo de colonias con iluminación puede ser de gran ayuda al momento del recuento. Es muy importante diferenciar una colonia de las partículas de alimento esparcidas en el medio de cultivo

1. Contar las cajas petri de todas las diluciones que contengan entre 25 y 250 colonias: Realizar un promedio de las colonias que se hayan contado en las cajas Petri de la misma dilución, y utilizando la ecuación descrita anteriormente, calcular el número de UFC/g ó ml del producto inicial.

1. Si sólo una caja petri de las dos contiene de 25 a 250 colonias, se debe contar ambas cajas petri y realizar un promedio del conteo: Si ninguna otra dilución contiene entre 25 y 250 colonias, se debe usar ésta para calcular el número de UFC/g ó ml del producto inicial.

1. Si dos diluciones consecutivas tienen de 25 a 250 colonias (por ejemplo: 10-4 y 10-5): Se debe calcular las ufc/g de cada dilución y reportar el promedio como ufc/g. ó ml. Pero si el mayor contaje es el doble del menor contaje, se debe reportar el menor contaje como ufc/g. ó ml.

1. Si todas las cajas petri contienen más de 250 colonias: Seleccione la muestra más diluida y estime el número contando una porción de la caja. Use un contador de colonias con una caja guía dividida en cm2 si es posible. Cuando hay menos de 10 colonias/cm, cuente 12 x 1cm2 y calcule el promedio

/cm2. Cuando hay más de 10 colonias/cm, cuente solo 4 x 1cm2 y calcule el promedio/cm2. El área de las cajas petri convencionales (15x100) es aproximadamente 56 cm2. Multiplique el número promedio/cm2 por 56 para determinar el número de colonias / caja petri. Luego calcule el número de ufc/g ó ml.

1. Si todas las cajas petri contienen menos de 25 colonias: Considere el número de colonias de la muestra menos diluida y reporte el contaje como un número estimado de ufc/g ó ml.

1. Si no hay colonias en ninguna de las cajas petri: Reporte el contaje estimado como menor a uno (< 1) y multiplique por el inverso de la menor dilución. Por ejemplo si inocula las diluciones de 10-3 a 10-7 y no observa ninguna colonia en ninguna caja, reporte como <1 x 103 ufc/g ó ml.

1. Colonias extendidas: Hay algunas bacterias que forman colonias grandes en agar. (Bacterias del género Proteus son invasoras y crecen extensivamente). Cuando se observan colonias extendidas que pueden ser consideradas como una sola colonia, solo en caso de que no exceda el 50% del área de la caja petri. Cuando la colonia excede el 50% de la caja petri, reporte esto como una colonia extendida

y no pueden ser utilizadas para calcular el número de ufc/g ó ml.

PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y DILUCIONES SERIADAS

1. De manera aséptica con instrumentos estériles y junto al mechero, pesar 25 gramos de una muestra de alimento en una funda estéril y resuspender en 225 ml de agua peptonada.
2. Homogenizar la muestra con el agua peptonada.
3. De esta manera se ha preparado la primera dilución 1/10 ó 10-1
4. La dilución 10-2 resulta de transferir 1 ml de la dilución anterior a 9 ml de agua peptonada y así sucesivamente hasta la dilución 10-3
5. El número de diluciones se establece de acuerdo al grado de contaminación de la muestra.
6. En este caso suponemos que la muestra tiene un elevado número de bacterias por lo tanto el número de diluciones recomendada es de 10-1 a 10-6

1. RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES

Es el recuento de organismos aerobios mesófilos para estimar la flora total presente en el alimento.

1. Rotule las cajas adecuadamente (en la base del agar).
2. Inocule 100ul de cada dilución (10-1 -10-6) en dos cajas que contengan Agar Nutritivo o Agar para conteo en placa.
3. Distribuir el inóculo en la superficie de manera aséptica empleando un asa de Digralsky (cultivo por extensión)
4. Debe absorber en el agar por unos pocos minutos
5. Incube a 37°C por 16-18h, asegúrese que el agar se encuentre en la parte superior de la caja.

1. RECUENTO DE COLIFORMES Y Escherichia coli

Es el recuento de coliformes totales y E. coli para estimar la flora total presente en el alimento.

1. Rotule las cajas adecuadamente (en la base del agar).
2. Inocule 100ul de cada dilución (10-1 -10-6) en dos cajas que contengan Agar Chromocult
3. Distribuir el inóculo en la superficie de manera aséptica empleando un asa de Digralsky (cultivo por extensión)
4. Debe absorber en el agar por unos pocos minutos
5. Incube a 37°C por 16-18h, asegúrese que el agar se encuentre en la parte superior de la caja.

DESCRIPCION DE LOS METODOS DE CULTIVO CULTIVO EN MEDIO SEMI-SÓLIDO:

Cultivo por vertido en placa

1. Limpiar su área de trabajo y tener el instrumental necesario para el cultivo
2. Ubicar la lámpara de alcohol en el área donde se va a manipular los medios de cultivo y las muestras para mantener un espacio estéril.
3. Con una micropipeta colocar de 1 hasta 5 ml de cultivo de interés en una placa Petri vacía etiquetada adecuadamente
4. Adicionar entre 20 y 25 ml de medio de cultivo agar estéril a 45°C para mantenerlo líquido
5. Homogeneizar con movimientos circulares la placa cerrada y dejar solidificar
6. Flamear las orillas de la placa, cerrar e incubar por 16h.[pic 3]

Figura 2. Método de siembra por vertido en placa

Cultivo por extensión

1. Limpiar su área de trabajo y tener el instrumental necesario para el cultivo
2. Ubicar la lámpara de alcohol en el área donde se va a manipular los medios de cultivo y las muestras para mantener un espacio estéril.
3. Con una micropipeta colocar 100 μL del cultivo de interés en la placa Petri etiquetada adecuadamente
4. Sumergir en alcohol el asa Digralsky, luego flamear y enfriar para esterilizar
5. Con ayuda de un asa Digralsky estéril dispersarla por toda la superficie de la placa hasta que se absorba todo el cultivo y dejar secar en reposo por 5 minutos.
6. Flamear las orillas de la placa, cerrar e incubar por 16h.

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Figura 3. Método de siembra por extensión

1. RECUENTO DE COLONIAS

1. Efectuar los contajes respectivos a las 24 y 48 horas.
2. Elegir las placas cuyos contajes se encuentren entre 25 y 250 UFC y seguir la guía para recuento microbiano.
3. Expresar los resultados como UFC/gramo ó ml de muestra aplicando la siguiente ecuación: UFC/ ml del cultivo =        # de colonias en la placa x inverso de la dilución original

Volumen de muestra inoculado en el medio

* 1 ml en caso de la técnica de vertido en placa

0,1 ml cuando se utiliza la técnica de estriado en placa.

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