Practica Electroforesis

Introducción

La concentración e integridad del ADN extraído, así

como el tamaño de distintos fragmentos de ADN

(por ejemplo, productos de PCR) pueden ser

verificadas mediante electroforesis en geles de

agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste

en la separación de moléculas (proteínas,

isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz

tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz

funciona como un filtro, separando las moléculas en

un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga

neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte

carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo

positivo (ánodo) durante la electroforesis.

La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a

través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la

electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño

migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la

concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel,

permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento

del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.

Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con

colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración

mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes

fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido

nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin

embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser

manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes

alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados

específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.

Objetivo

Realizar una electroforesis de agarosa del DNA extraído en las prácticas anteriores con el fin de

verificar su integridad.

Materiales

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Molde para realizar geles

Cubeta electroforética horizontal

Fuente de poder

Matraz erlenmeyer de 250ml

Peine para pozos de electroforesis

Microondas

Agarosa

Fotodocumentador UV

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Micropipetas

Muestras de ADN

Solución de bromuro de etidio

Guantes

Buffer de carga 6x (azul de

bromofenol (0.25%), xilencianol,

glicerol)

Buffer TAE 1X

Procedimiento

1. Se preparó de un minigel de agarosa al 1% (p/v) (0.30 g) en 30 ml de buffer TAE 1X

2. Se enfrió hasta que se pudiera tocar, se vertió la solución caliente en una cubeta

electroforética debidamente preparada y colocó el formador de pocillos (peine) en la

posición adecuada.

3. Se dejó gelificar la agarosa (aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente).

4. Se sumergió el gel en la cámara de electroforesis. Se añadió el buffer de electroforesis TAE

1X, de modo que rebasó el gel aproximadamente 1mm.

5. Se cargaron las muestras de DNA en cada pocillo colocando 4ul de buffer carga + 10ul de

muestra. Además en el primer pocillo del peine se incluyo un marcador de peso molecular

(4ul de marcador de DNA). El gel se dejó correr aproximadamente 30 minutos a 100 volts.

6. Se retiró el gel de la cámara electroforética y procedió a la tinción.

7. Se dejó reposar el gel en una solución con bromuro de etidio (0.5ug/ml) por 2 minutos,

teniendo extrema precaución.

8. Se realizaron lavados con agua destilada.

9. Se observó el gel a la luz UV en un fotodocumentador.

Resultados

M

M: Marcados molecular

1:

...