Preparacion Y Esterilizacion De Materiales

INTRODUCCION

En todo laboratorio de Microbiología es necesario que el área de trabajo así como los materiales a utilizar durante las prácticas, estén debidamente esterilizados y/o desinfectados; siendo ésta, una medida preventiva para proteger la salud y la seguridad de quienes están en contacto directo con cualquier tipo de agente biológico, físico o químico; definiéndose esterilidad, como la condición en la cual hay ausencia de cualquier microorganismo. Los métodos de esterilización más comunes son: calor seco (estufas de aire seco), calor húmedo (autoclave), flameado (mecheros) y algunas soluciones químicas (hipocloritos, yodoformos, peróxidos, amonios, fenoles y formaldehidos).

Este se procedimiento se debe realizar antes y después de la práctica para evitar cualquier riesgo de contaminación ya sea de los materiales, de los cultivos o de las personas que se encuentran dentro del laboratorio. De no hacerlo, podría afectar los resultados de la práctica o la salud y seguridad de quienes la realizan.

OBJETIVOS

• Reconocer los métodos, materiales y dispositivos, usados para la esterilización de cualquier elemento en el laboratorio de microbiología, así como su debido uso y manipulación.

• Preparar los materiales o elementos requeridos para luego ser llevados al autoclave u horno (dispositivos más comunes y útiles para la esterilización).

• Distinguir adecuadamente las propiedades de los materiales para así, realizar el debido proceso de esterilización.

• Aprender a desinfectar el área de trabajo y adquirir el hábito de hacerlo antes y después de cada practica.

• Diferenciar las propiedades básicas de él autoclave y horno, tales como temperatura, tiempo y presión (siendo esta última solamente del autoclave).

• Conocer los diferentes métodos de esterilización y los desinfectantes más usados dependiendo del nivel que se requiera.

• Aprender utilizar adecuadamente los diferentes instrumentos del laboratorio, para así lograr una adecuada esterilización.

METODOLOGIA

Para la realización de la práctica se requirió el uso de los siguientes materiales:

• Materiales a esterilizar:

o 5 cajas de petri

o 1 pipeta

o 1 balón aforado

o 1 pipeteador

• Materiales para esterilizar:

o Papel kraft

o Cinta indicadora o cinta de enmascarar

o Autoclave

o Estufa

PREPARACIÓN DE LOS MATERIALES A ESTERILIZAR:

Para realizar la esterilización, primero se deben recubrir los materiales con papel Kraft, asegurándolos con cinta indicadora o en su defecto con cinta de enmascarar. Luego de esto se pasa a utilizar el método que más convenga de acuerdo al tipo de material que se vaya a utilizar.

Autoclave (calor húmedo): Verificar que está apagada, retirar la olla que se encuentra al interior del autoclave. Llenar el tanque de agua hasta el nivel indicado ( 2 pulgadas). Colocar los materiales previamente recubiertos dentro de la olla e introducir esta en el autoclave. Después se ha de poner la tapa, asegurándose de que el tubo flexible de la tapa coincida con el compartimento, y mirar que la flecha de la tapa coincida con la señal al exterior del autoclave. Ahora se deben ajustar los pernos de la tapa, asegurándose uno a uno y siempre que se cierre uno, se ajusta el opuesto. Ajustar el termostato al máximo y encender la autoclave, ahora, se debe esperar unos 15 minutos hasta que se llegue a unas 15 psi y a 121 °C. Cuando se llegue a esto se debe apagar el autoclave y abrir la válvula de control, hasta que se libere totalmente el vapor del interior y se enfríe, para así abrir los pernos, sacar la tapa y sacar los materiales ya esterilizados, sin quitar el papel kraft hasta que se vayan a usar, ya que si se hace eso antes, se contaminaran los materiales. A la hora de usarlos es importante tener en cuenta que se debe tener prendido un mechero muy cerca del lugar de trabajo , para así asegurar que no se contaminen los materiales.

Fig.1 Autoclave antes de introducir los materiales

Estufa (calor seco): Para hacer la esterilización de materiales en la estufa, primero se ha de asegurar que esté apagada y fría, para así introducir los materiales a esterilizar, previamente recubiertos con papel Kraft, así, se cierra la puerta de la estufa y se enciende, dejando los materiales por dos horas a unos 160° C, pasado este tiempo se apaga la estufa y se espera a que se enfríe, de igual manera como en el proceso anterior, se sacan los materiales sin quitar el papel kraft hasta su uso.

Fig.2 Estufa antes de introducir los materiales

RESULTADOS

A partir de la práctica de laboratorio se obtuvieron las siguientes imágenes de los elementos a esterilizar:

Fig. 3-4 Cajas de petri, matraz aforado, pipeta y pipetiador despues de envolverlos en papel Kraft, y listos para realizar su esterilizacion.

De acuerdo a la información previa, el procedimiento que se realizo de manera abreviada fue el siguiente:

1. Se envolvieron las cajas de petri y pipeta con papel kraft, se llevaron a la estufa a 160° C durante dos horas, luego se apagó, se dejo enfriar una hora más y se procedió a sacarlos.

2. Se envolvió el pipeteador y balón aforado con papel kraft, se llevaron a la autoclave cubriéndolos con una toalla de papel a 15 lb de presión 121 ° C durante 15 minutos (hasta que alcanzo la presión requerida); y se procedió a sacarlos.

Se hace necesario mencionar que los elementos después de ser sacados fueron guardados para el próximo laboratorio, de esta manera, no se realizo la prueba de azul bromotimol sugerida en la guía.

DISCUSION

Mediante el autoclave se pueden esterilizar gran variedad de objetos y líquidos tales como medios de cultivo preparados, escobillones, gasas entre otros siempre que no contengan antibióticos ya que pueden perder actividad, proteínas que coagulen azucares, entre otros; en este caso se utiliza otro método de esterilización llamado filtración, en este proceso se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Hay que tener en cuenta que los filtros que se utilizan generalmente en los laboratorios no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice.

Existen tres tipos básicos de filtros:

• FILTROS PROFUNDOS O FILTROS DE PROFUNDIDAD: Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes. En este tipo de filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz.

• MEMBRANAS FILTRANTES: Tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriz del filtro debido a efectos electrostáticos.

• FILTROS DE HUELLA DE NUCLEACIÓN (NUCLEOPORO): Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro.

En el caso particular de la práctica se utilizo el autoclave para esterilizar el pipeteador (por ser de plástico) y el balón aforado (por tener un tapón que facilita el enrase definitivo) y el horno para esterilizar las cajas de petri y la pipeta por ser de materiales de vidrio a su vez se pudo regular su temperatura con ayuda de un termostato (el cual se compone de una tira metálica que opera como conmutador con interruptor eléctrico, conectada a un aparato de calentamiento), éste, requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor. El vapor de agua es mucho más penetrante que el calor seco lo que permite que la autoclave pueda trabajar a temperaturas más bajas que la estufa y durante menos tiempo y conseguir el mismo resultado.

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: - El agua es una especia química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua. Y El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

El calor húmedo puede penetrar más rápidamente que el calor seco porque las moléculas de agua conducen mejor el calor que las moléculas de aire. Por ello el calor húmedo puede ser usado a temperaturas más bajas y menor tiempo de exposición que el calor seco.

No se pudo comprobar si la esterilización fue efectiva o no, ya que no se abrieron los elementos, para conservarlos estériles para la próxima practica de laboratorio, sin embargo de manera visual se puedo apreciar que la tapa del autoclave no quedo debidamente cerrada ya que en el momento de retirarla (al haber alcanzado la presión necesaria y el tiempo requerido) estaba muy pegada por haber quedado en desnivel.

Después de realizado el proceso de esterilización podemos considerar que los elementos permanecen sin ser contaminados bajo condiciones óptimas de almacenamiento (en la nevera) y al tocarlos mínimamente (solo se debe retirar el papel kraft cuando se necesiten en la práctica), y se deben mantener íntegros y secos en un lugar secos o de baja humedad, de temperatura moderada y por el cual no pase mucha gente.

Además al envolver objetos, se recomienda doblar en punta al material para que se puedan abrir los paquetes sin contaminar lo que hay adentro.

Los instrumentos deben estar secos antes de sacarlos de la autoclave. Los paquetes que aún estén húmedos pueden atraer microorganismos del ambiente una vez que estén fuera de la autoclave y de esta manera se podrían contaminar.

Luego al esterilizar con calor seco se tuvo en cuenta que se debe mantener una temperatura (160-180° C) por 2 horas. Por este método se debe utilizar únicamente para los objetos de vidrio o de metal se debe. No podemos usar este método para otros objetos tales como guantes o materiales de plástico, pues estos objetos se quemaran o se derretirán, ni para medios de cultivo o agua porque se evaporan hasta secarse.

La utilización del calor seco y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. EL calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

CONCLUSIONES

• La autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura.

• Cuando manejamos cualquier tipo de muestra debemos evitar que microorganismos ajenos a nuestros cultivos y presentes en el ambiente se introduzcan en ellos contaminándolos, o que los microorganismos de la muestra nos contaminen a nosotros.

• Los hornos son gabinetes provistos de un calentador ínter construido, que nos permite obtener temperaturas más elevadas dentro del gabinete que las que hay afuera, logrando esterilizar elementos de vidrio.

• No se recomienda utilizar el horno para medios de cultivo o agua pues se evaporan hasta secarse.

• Para garantizar una esterilización completa en el horno se utiliza una cinta indicadora de esterilidad, la cual se torna de color café al finalizar.

• Los desechos de cada práctica deben ser debidamente esterilizados y luego desechados.

• La sustancia química más usada para desinfectar las áreas de trabajo y equipo es el alcohol, el cual se esparce con ayuda de un trapo limpio (este debe ser lavado después de cada practica para garantizar un alto nivel de limpieza).

• Existen tres métodos de esterilizar los instrumentos y el área de trabajo que son el calor húmedo, calor seco y con sustancias químicas.

• Esterilizar el instrumental a calor húmedo en autoclave es uno de los métodos más comunes que se usan en las prácticas de laboratorio debido a su eficacia y rapidez.

• En el caso de calor húmedo la evada temperatura que imposibilita la esterilización de materiales termos sensibles.

• Todo el material esterilizado debe ser debidamente almacenado para que no se contamine y así al utilizarlo evitar variaciones en los resultados de las pruebas que se realicen.

REFERENCIAS

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http://aline-m-e-p.blogspot.com/2012/04/practica-2-preparacion-y-esterilizacion.html

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