Práctica. Determinación de urea, creatinina y ácido úrico

PRÁCTICA 7 

DETERMINACIÓN DE UREA, CREATININA Y ACIDO URICO.

UNIDAD V: Compuestos nitrogenados y su metabolismo.

OBJETIVOS 

Objetivo general 

1. Determinación cuantitativa de urea, creatinina y ácido úrico en suero humano mediante el empleo de kits de diagnóstico clínico.

Objetivos específicos

1. Realiza el diagnóstico clínico de las muestras sanguíneas procesadas a través del análisis de los resultados obtenidos.

RESULTADOS 

Tabla 1. Datos de Paciente 

Tabla 2. Resultados de la determinación de urea

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Figura 1. Grafica de la absorbancia contra tiempo de la UREA.

Cálculos para la determinación de urea

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Tabla 3. Resultados de la determinación de creatinina

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Figura 2. Grafica de la absorbancia contra tiempo de creatinina.

Cálculos para la determinación de creatinina

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Tabla 4. Resultados de la determinación de ácido úrico

Cálculos para la determinación de ácido úrico

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Tabla 5.  Resultados de las concentraciones calculadas

Tabla 6. Valores de referencia

DISCUSIÓN

En primera instancia, es importante mencionar que para la determinación de urea se llevó a cabo un método enzimático-cinético. Como podemos ver, en la primera reacción, ninguno de los elementos que participan directamente pueden absorber la luz, por lo que es necesario acoplar una segunda reacción en la que el sustrato presente un máximo de absorción. Para empezar, el amoniaco (NH3), que es el producto de la primera reacción, se usa como sustrato de una segunda reacción, y el alfa-cetoglutarato y el NADH junto con el glutamato deshidrogenasa (GLDH) deben encontrarse a concentraciones saturantes para que la velocidad de la segunda reacción sea la máxima. De esta manera, analizando esta segunda reacción podremos evaluar la actividad enzimática de la primera.

En la mayoría de los análisis enzimáticos se utilizan las características de la coenzima NAD+, porque tienen la propiedad óptica de absorber luz a 340 nm cuando está en forma de NADH (reducida). Por otro lado, la reacción enzimática se mide por el decremento de la Absorbancia a medida que el NADH se oxida, así, la actividad de una oxidorreductasa que use NADH como coenzima puede ser monitorizada siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume el NADH.

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En este caso fue usual el uso de la luz ultravioleta (luz UV), con una longitud de onda a 340 nm, punto en el que se encuentra la porción UV del espectro. Esto se utilizo porque especialmente sirve para monitorizar reacciones en las que participa el NADH, y coenzimas que participan en infinidad de reacciones bioquímicas y que absorben luz UV en forma reducida (NADH), pero no en forma oxidada (NAD+)

Por último, se midió la absorbancia en diferentes intervalos, los cuales fueron de 30S y 90S con un minuto de diferencia. En este caso, el primer punto de medición, llamado fase de adaptación o retardo, tiene lugar inmediatamente después de mezclar los reactivos con la muestra biológica. Por lo que es una fase de encuentro, acoplamiento de sustrato y enzima; su duración en este caso fue de segundos.

A medida que fue transcurriendo la reacción y el tiempo, se midió la absorbancia en 90S, lo que quiere decir que llegó un momento en que el sustrato u otro reactivo se fue agotando (fase de agotamiento de sustrato) y la velocidad de reacción disminuyó hasta anularse.

En segundo lugar, para la determinación de creatinina se empleó un método colorimétrico-cinético que se basa en la reacción de Jaffé. Como se puede ver en la reacción, la creatinina reacciona con el ácido pícrico en un medio alcalino formando un complejo de color rojo a una longitud de onda de 492 nm. No obstante, la creatinina no es la única que reacciona, por eso es por lo que tiene baja especificidad. Existen interferentes positivos, entre ellos las proteínas, glucosa, acetoacetato, ácido ascórbico y ácido úrico, e interferentes negativos, y de ellos el más importante es la bilirrubina. Frente a muestras con bilirrubinas elevadas, los valores de creatinina se ven disminuidos porque la bilirrubina en el medio alcalino se oxida a biliverdina formando un compuesto incoloro que disminuye el color de la reacción; otra interferencia negativa, pero que adquiere más relevancia en neonatología es la hemoglobina de origen fetal, que, a diferencia de la hemoglobina del adulto, es resistente al álcali; de esta manera, hace que cambie lentamente el color a lo largo del curso de la reacción, alterando y disminuyendo la coloración de la reacción.

Como se mencionó, basado en la reacción de Jaffé en los métodos colorimétricos, la forma de efectuar la lectura fue cinético, lo cual, en este caso fue más útil para minimizar las interferencias positivas. Se puede decir que las interferencias positivas se logran minimizar ya que poseen distinta velocidad de reacción. Hay algunos interferentes positivos de reacción muy rápida, con los cuales en los primeros 10 segundos se considera que ya se produjo su reacción, por ejemplo, el acetoacetato. Por otro lado, la gran mayoría son productos de reacción más lenta (de 3 a 5 minutos), tales como las proteínas, glucosa, ácido ascórbico y ácido úrico.

En cuanto a los tiempos de lectura, es importante mencionar que no sólo se deben efectuar al principio, ya que solo reaccionarían las interferentes de reacción rápida, sin reaccionar la creatinina; tampoco se deben realizar en un único punto al final, porque se leerían tanto creatinina como interferentes. En este caso, se efectuaron dos lecturas: una primera lectura rápida a los 30 segundos para eliminar interferentes de reacción rápida, y una segunda lectura a los 90 segundos, antes que actúen los interferentes de reacción lenta, y la creatinina ya haya reaccionado. Por lo tanto, al obtener la lectura de las absorbancias en cada tiempo, la diferencia de estos dos tiempos de lectura ayuda a calcular la concentración de la creatinina.

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