PÁCTICA CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
Enviado por Fernanda Lorencez • 24 de Enero de 2021 • Prácticas o problemas • 1.735 Palabras (7 Páginas) • 113 Visitas
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS[pic 1] |
PÁCTICA
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVO GENERAL
Establecer una curva de crecimiento para Escherichia coli, identificando sus fases, mediante las técnicas de espectrofotometría y conteo en placa.
INTRODUCCIÓN
Cuando se inocula un microorganismo en un medio de cultivo líquido, éstos crecen por lo general hasta que el sustrato llega a muy bajas concentraciones y por ello el crecimiento se ve limitado. Si durante este proceso no se adiciona ningún nutriente ni se elimina ningún producto metabólico, este crecimiento, se denomina cultivo por lote. EI crecimiento de un cultivo bacteriano se ve claramente en la representación gráfica, cuando se expresan los logaritmos del número de células viables frente al tiempo. Una curva de crecimiento típica (Figura 1) tiene un aspecto sigmoidal y permite diferenciar varias fases de crecimiento:
1. Fase de latencia (o lag). Abarca el lapso entre la inoculación y el momento en que se alcanza la tasa de división máxima. La duración de la fase de latencia depende sobre todo del cultivo previo, de la edad del inóculo, así como de lo apropiado que sea el medio de cultivo.
2. Fase exponencial (log). Se caracteriza por un tiempo de generación constante y mínimo. E. coli a 37°C se divide aproximadamente cada 20 min. En esta fase desciende la concentración de sustrato, aumenta la densidad celular y se acumulan productos metabólicos.
3. Fase estacionaria. La transición de la fase exponencial a la estacionaria tiene lugar paulatinamente. En esta fase pueden utilizarse aun materiales de reserva, descomponerse parte de los ribosomas y sintetizarse enzimas. La velocidad específica de crecimiento y la velocidad de muerte son casi iguales.
4. Fase de muerte. La muerte celular se define como pérdida irreversible de la capacidad de reproducción. El número de células viables puede descender exponencialmente. Según las circunstancias, las células pueden lisarse par acción de los propios enzimas (autolisis).
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Figura 1. Curva de crecimiento típica de una población microbiológica.
Para realizar la cuantificación, a veces, la muestra original se tiene que diluir, ya que en algunas técnicas resulta imposible contar cantidades elevadas de microorganismos. Existen varios métodos para la cuantificación de microorganismos en suspensión:
- Turbidimetría. Utiliza como patrones suspensiones de microorganismos con concentraciones conocidas de ellas.
- Cámara de Petroff-Hausser y el hemocitómetro (cámara de Neubawer). Conteo directo al microscopio.
- Conteo en placa. Puede ser por extensión o vaciado en placa. Consiste en depositar una alícuota del inóculo en una caja de Petri e incubar. Cada microorganismo se desarrolla y reproduce hasta dar origen a una masa visible de organismos (colonia), por lo que se cuentan Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
- Peso seco y húmedo. Se cuantifica la masa total de microorganismos mediante diferencia de pesos.
- Espectrofotometría: Se basa en el uso de un espectrofotómetro que proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica, siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias.
Mediante la curva de crecimiento se pueden determinar parámetros cinéticos para cada microorganismo bajo condiciones específicas.
MATERIALES Y REACTIVOS
Material biológico (por grupo) | Reactivos (por grupo) |
Sesión antes del día programado para la segunda sesión, día de la cinética) Tres cultivos de 10 mL de la cepa E. coli de 12-24 h de crecimiento en caldo nutritivo | Sesión 1 Agar nutritivo 23g/L Caldo nutritivo 8g/L Agua destilada |
Material por equipo | Material y equipo por grupo |
Sesión 1 3 matraces de 500 mL (uno para preparar caldo nutritivo y dos para agar nutritivo 1 vaso de precipitado de 250 mL 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL 2 tubo de ensaye de 13x100 mm c/taparosca 1 probeta de 250 mL 1 probeta de 100 mL 100 tubos eppendorf de 1.5 mL (limpios y separados) 2 espátulas 2 agitadores magnéticos 2 cajas de puntas de 100-1000 microlitros 2 cajas de puntas de 20-200 microlitros 1 gradilla para tubos de ensaye 1 pipeta serológica de 5 0 10 mL 1 propipeta Sesión 2 1 Micropipeta 100-1000 µL 1 Micropipeta 20-200 µL 1 caja de Petri de vidrio 1 gradilla para tubos Eppendorf 1 gradilla para tubos de ensaye 2 celdas para espectrofotómetro | Sesión 1 4 matraces Erlenmeyer de 1 L 3 Placas de calentamiento /agitación 1 Espectrofotómetro 1 autoclave 3 balanzas analíticas 1 incubadora con agitación a 37°C 1 incubadora de convección a 37°C 1 horno para secado de material a 70°C 1 vortex |
Material a traer por el alumno | |
Sesión 1 2 Frascos de vidrio de mayonesa de boca ancha (con taparosca metálica) 3 Frascos gerber de boca ancha 40 cajas de Petri desechables estériles Pañuelos Kleenex 2 Vasos de polipropileno de 1L 1 Varilla de extensión 1 Hielera unicel (pequeña, como para tortillas) Hielo escarchado (día de la cinética) |
METODOLOGIA
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