Crecimiento Microbiano

2. MEDIDAS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

a.

Recuentos en placa o de colonias

Es el método más usado para medir poblaciones bacterianas, ya que a diferencia de otros permite contabilizar el crecimiento de células viables, es decir células que pueden dar una descendencia. Su principal desventaja es que requiere mínimo 24 horas para conocer los resultados del recuento y en la industria a veces se requieren resultados más rápidos. Es muy usado en la microbiología de alimentos, pero puede ser impreciso cuando se toman muestras naturales, como por ejemplo el suelo; donde no todos los microorganismos a pesar de estar presentes en la misma muestra podrán crecer en el medio de cultivo seleccionado dado a la diferencia de requerimientos nutricionales.

Esta técnica se fundamenta en que cada colonia está compuesta por un solo tipo de bacteria. Los recuentos se informan en unidades formadoras de colonias (UFC). Existen dos métodos para realizar el recuento en placa: el método de placa vertida o el método de extensión en placa (figura 1). Cuando el número de colonias en placa supera el de 300 UFC es recomendable realizar diluciones seriadas para diluir el inóculo original y facilitar el conteo.

Figura1. Métodos de recuento en placa de células viables (tomado de Madigan et al. 2003).

Método de extensión en placa

Se coloca un volumen de inóculo no superior a 0.1 ml (100 µl) sobre la superficie de un medio de cultivo y se extiende uniformemente por toda la placa con un asa o varilla de vidrio estéril hasta que el medio lo absorba por completo, posteriormente se incuba a una temperatura determinada hasta que aparezcan las colonias y así realizar el recuento.

Método de placa vertida

Sobre una placa estéril sin medio de cultivo se agrega cierto volumen del inóculo (0.1 – 1.0 ml) al que se añade el medio de cultivo con una temperatura de 45 o 50 °C, luego se agita suavemente la placa para mezclar, después que el agar se solidifica y se incuba las colonias crecerán y en la superficie del agar. El principal inconveniente de este método es que ciertos microorganismos sensibles al calor pueden verse dañados por la temperatura del agar fundido. Ver figura 23.

Método de diluciones seriadas

Cuando una muestra contenga muchos microorganismos que superen las 300 UFC se recomienda realizar diluciones seriadas que faciliten el conteo y permita obtener resultados confiables; luego de las diluciones se siembran las placas y se procede a hacer el conteo del número de colonias que debe ser multiplicado por el factor de dilución para obtener las UFC por mililitro de muestra original (figura 2).

Figura 2. Método de diluciones seriadas para recuento en placa de colonias (tomado de Tortora et al. 2007).

Filtración

Es un método muy usado en microbiología de aguas cuando la concentración de bacterias presentes en la muestra es muy baja. Para la filtración por membranas 100 ml de agua atraviesan un filtro con poros muy pequeños que no pueden pasar las bacterias, las cuales se quedan en la superficie del filtro, éste se transfiere a una almohadilla con medio de cultivo donde las colonias pueden crecer y con una incubación previa hacer el recuento. Es una técnica muy usada para detectar y cuantificar bacterias de contaminación fecal (coliformes fecales).

Recuento microscópico directo

En esta técnica un volumen definido se coloca en un portaobjetos para luego ser observado al microscopio. El método de recuento de Breed es muy usado en la industria láctea, en éste se colocan 0.01 ml de muestra sobre un portaobjetos con un recuadro de 1 cm2 que se tiñe con un colorante para luego contar las células observadas con el objetivo de 100X, al final el número de bacterias contadas se multiplica por 100. Los recuentos microscópicos también se realizan usando la cámara de Petroff-Hausser; estos métodos no requieren tiempo de incubación (Tortora et al. 2007).

Entre las principales desventajas del recuento directo tenemos: se pueden contar células muertas y vivas, dificulta el conteo de bacterias móviles, se requieren concentraciones de bacterias adecuadas

b.

Recuento de colonias o recuento estándar en placa

Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan después de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el número de células aisladas o microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, también se utiliza para el conteo de esporas fúngicas presentes en la muestra.

La muestra a inocular debe ser homogénea y no contener conglomerados de células. Después de la incubación cada microorganismo o célula viable formará una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el número de colonias permitirá a su vez determinar el número de organismos viables en la muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad.

c.

Diluciones:

Se tiene el extracto de suelo, se toma 1 ml de este y se adiciona a un tubo de ensayo que contiene 9ml de solución salina, esto se mezcla en el vortex por un minuto, luego se extrae nuevamente 1 ml de tubo de ensayo y se agrega a un nuevo tubo y se repite el mismo procedimiento 7 veces ( 107).

d.

QUIMIOSTATO

El quimiostato es un sistema de fermentación ene! que se introduce una suspensión del me-dio de cultivo (sustrato) en el fermentador, a una velocidad definida e igual a la velocidad de salida del medio de cultivo (el medio de cultivo que sale contiene muchos microorganismos o metabolitos

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