Separación y aislamiento de enzimas

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son moléculas orgánicas constituidas por aminoácidos proteicos que actúan como catalizadores biológicos, se encuentran distribuidos ampliamente en los sistemas vivos, y son un mayor factor en el crecimiento, mantenimiento y propagación de los mismos, de hecho, cualquier alteración producida puede conducir a una condición patológica e incluso la muerte. Su estructura, naturaleza química ocurrencia y funcionamiento están dadas por la secuencia de aminoácidos que las conforman, conocer estas cualidades permite diseñar un protocolo eficiente para la extracción, purificación e inmovilización. En las células existen un elevado número de proteínas, muchas de las cuales son enzimas; por lo que para estudiar y caracterizar una proteína concreta previamente hay que aislarla y purificarla.

Algunas enzimas son más delicadas respecto a otro referente a la permanecía de su actividad, lo cual limita los procesos de purificación, por lo que conocer la naturaleza bioquímica del enzima permite utilizar diversas metodologías tecnológicas que favorezcan un mantenimiento de la actividad enzimática, Algunos métodos utilizados son la precipitación fraccionada, diálisis, precipitación mediante el calentamiento moderado, con algún ácido o concentraciones de alcohol-cetona. Es importante el método de homogeneizado para obtener de él las enzimas que se encuentran dentro de un tejido. En las enzimas es necesario realizar técnicas de purificación como análisis por ultracentrífuga, el electroforético pero por lo general al realizar estos procedimientos se puede perder gran cantidad de la enzima obtenida. Por lo tanto, el objetivo de esta práctica es conocer las técnicas de aislamiento de enzimas de uso en biotecnología para reducción de almidones

1. OBJETIVOS

• Conocer las técnicas de aislamiento de enzimas de uso en biotecnología para reducción de almidones

1. FUNDAMENTO TEORICO

1. ENZIMAS

Las enzimas son moléculas orgánicas constituidas por aminoácidos proteicos que actúan como catalizadores biológicos, se encuentran distribuidos ampliamente en los sistemas vivos, y son un mayor factor en el crecimiento, mantenimiento y propagación de los mismos, de hecho, cualquier alteración producida puede conducir a una condición patológica e incluso la muerte. Su estructura, naturaleza química ocurrencia y funcionamiento están dadas por la secuencia de aminoácidos que las conforman, conocer estas cualidades permite diseñar un protocolo eficiente para la extracción, purificación e inmovilización. En las células existen un elevado número de proteínas, muchas de las cuales son enzimas; por lo que para estudiar y caracterizar una proteína concreta previamente hay que aislarla y purificarla. (Velin & Briceño, 2016)

1. CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

Se clasifican en clases y familias que están ampliamente distribuidas en animales, plantas y microorganismos, Además, se pueden encontrar enzimas proteolíticas sintetizadas de diferentes maneras:

Origen animal: Son proteínas obtenidas a partir de los tejidos de diferentes organismos como el estómago o el páncreas. Las principales enzimas dentro de esta clasificación son la tripsina, pepsina, pancreatina, colagenasa y pronasa. Estas enzimas trabajan a pH ácido (Arroyo, Acebal, & De la Mata, 2014)

Origen vegetal: Extraída a partir de especies de frutos y plantas, principalmente de la familia Bromeliaceae (bromelina), Caricaceae (papaína) y Moraceae (ficina) a partir de la piña, papaya e higo, respectivamente mediante procesos de ruptura celular, precipitación y purificación (Arroyo, Acebal, & De la Mata, 2014)

Origen fúngico: Los productores de enzimas proteolíticas a partir de cepas de origen fúngico son productoras de enzimas proteolíticas extracelulares mediante fermentación en medio líquido, una tecnología ambientalmente sustentable, pues se pueden utilizar sustratos biodegradables. Al ser componentes extracelulares, son de fácil recuperación. Entre los principales productores de proteasas de origen fúngico, se encuentran especies de los géneros Mucor, Aspergillus y Rhizopus (Arroyo, Acebal, & De la Mata, 2014)

1. MÉTODOS DE SEPARACIÓN ENZIMÁTICA

En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificación (Velin & Briceño, 2016)

Los métodos a elegir dependen de la fuente biológica y de la concentración de la enzima, y se basan en las distintas propiedades fisicoquímicas de las proteínas. El primer paso consiste en la separación de los distintos componentes intracelulares, generalmente por centrifugación. Las partículas que difieren en densidad o tamaño sedimentan a distintas velocidades por aplicación de una fuerza centrífuga (campo gravitacional, g). Una centrifugación diferencial permite la separación del homogenado en varias fracciones (Arroyo, Acebal, & De la Mata, 2014)

1. Centrifugación diferencial

El método clásico utiliza una serie de tres pasos de centrifugación diferencial, con velocidades sucesivamente mayores y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante, el sobrenadante de cada paso es centrifugado en el siguiente. Este procedimiento proporciona tres sedimentos que son las fracciones nucleares, mitocondriales y microsómica. Ninguna de las fracciones está compuesta de organelas absolutamente puras, sin embargo, se ha establecido que existen algunas enzimas u otro compuesto químico característica de cada una de las tres fracciones, pudiendo servir como marcadores

1. Filtración a través de la membrana

Un método alternativo para la clarificación de extractos celulares es la filtración. Sin embargo, las preparaciones microbianas frecuentemente son gelatinosas y por ello difíciles de filtrar por los métodos tradicionales a menos que se empleen áreas de gran tamaño para la filtración. Para evitar estos problemas se utiliza la filtración tangencial o de flujo cruzado. En este método el flujo del líquido forma Angulo recto con la dirección de filtración, de tal forma que una velocidad de flujo suficientemente elevada puede minibar el bloqueo de filtrado.

1. EXTRACCION Y PURIFICACION DE ENZIMAS

El proceso para el aislamiento y la purificación de enzimas está compuesto de distintas etapas como son la preparación de la muestra, la extracción de la enzima, el aislamiento y su purificación e inmovilización. En cada una de las etapas se lleva a cabo de forma específica, de acuerdo a la muestra que se posea. (Sinche, 2009). En general estos métodos son requeridos por las siguientes razones

• Para el estudio de varios aspectos de una enzima en partículas.
• Identificación de sustratos y de sustratos específicos de la enzima.
• Evaluar el roll de varias coenzimas o cofactores en el momento de la reacción.
• Propósitos terapéuticos.
• El desarrollo del sistema de enzimas inmovilizadas para aplicaciones industriales, fermentaciones y valoración procesos.
• Enzimas puras también son empleadas en estudios forenses, procesamiento de alimentos, y para la síntesis de antienzimas las cuales tienen valor médico.
• Los estudios de inhibición de enzimas pueden indicar potencial inhibidor los cuales pueden ser usadas para el tratamiento metabólico y desordenes hereditarios.

El aislamiento de enzimas extracelulares es sencillo que el de las enzimas extracelulares, debido a que estas son más fáciles de recolectar ya que no se requiere de la destrucción de tejidos y por lo tanto reduce costos y tiempos requeridos para procesos como la homogenización y cualquier otro tipo de procesos.

1. MÉTODOS DE PURIFICACION Y EXTRACCIÓN DE ENZIMAS

Existen variadas técnicas y metodologías para la purificación de proteínas, pero cada una de ellas consiste en separar la enzima de interés de otras proteínas y macromoléculas, manteniendo la mayor actividad enzimática posible. Algunas de las técnicas más comunes son:

1. SEPARACION POR PRECIPITACIÓN

Las diferencias en comportamientos de solubilidad han sido usadas por más de 50 años para la separación de proteínas (Weatherley, 1994). Actualmente, la precipitación es usualmente utilizada como un paso de separación durante las primeras etapas de un proceso de purificación, y normalmente es seguida por otro tipo de separaciones, como la cromatografía. La precipitación puede ser utilizada también como método de concentración de proteínas como paso previo a un proceso de purificación (Herrera, 2019)

Lo anterior se debe a que a pesar de que los procesos de precipitación pueden ser aplicados de manera fácil y reproducible, el diseño de estos no es tan sencillo, ya que no existe aún una teoría predictiva para analizar las posibles relaciones que existen entre los métodos, y consecuentemente el diseño de estos procesos continuará como un ejercicio empírico que necesita largas horas de mediciones en el laboratorio (Herrera, 2019)

 “salting-out”

(también conocido como precipitación inducida por sal, fraccionamiento de la sal, cristalización antisolvente, cristalización por precipitación o ahogamiento) es una técnica de purificación que utiliza la solubilidad reducida de ciertas moléculas en una solución de muy alta fuerza iónica. El ahogamiento se utiliza normalmente para precipitar grandes biomoléculas, como las proteínas o el ADN. (Herrera, 2019)

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