TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

I. FUNDAMENTO

1.1. Tinción:

Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.

Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.

De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

a) Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

b) Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan mas de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.

Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.

1.2. Colorantes:

Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los poli sacáridos ácidos (las envueltas externas de los microorganismos están por lo general cargadas negativamente).

1.3. Tinción diferencial de Gram:

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativos (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicamente distintos de bacterias).

Las bacterias grampositivas y gramnegativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica.

El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano a sí como algo de ácido teicoico.

Generalmente, 80% - 90% de la pared de la célula grampositiva es peptidoglicano.

La pared de la célula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gramnegativa es peptidoglicano.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:

1. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.

2. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas.

3. Cultivos de más de 24 horas de teñidos pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.

II. OBJETIVOS:

Brindar al estudiante herramientas básicas en la confección y el manejo de extendidos y la tinción de los mismos de acuerdo a la observación que se desee realizar.

III. MATERIAL:

- Portaobjetos

- Cubreobjetos

- Microscopio óptico

- Solución de cristal violeta al 1 %

- Solución de azul de metileno al 1 %

- Solución de safranina al 1 %

- Solución decolorante (alcohol etílico y acetona 1:1)

- Solución de I2/ I (yodo / yoduro al 0.1 %)

- Muestra bacteriológica de origen natural: Sarro dental, yogur, etc.

- Asa de siembra o aguja enmangada.

- Palillos o mondadientes

- Aceite de inmersión.

- Soporte de tinción.

- Gotero.

- Mecheros de Bunsen o de Alcohol.

- Pinzas

- Alcohol etílico.

- Agua destilada.

IV. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparación del extendido previa a la coloración

- Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el centro del mismo una gota del cultivo líquido, mediante asa de platino.

- Si el cultivo es sólido, se coloca primero una gota de solución fisiológica o agua destilada estéril sobre el portaobjeto. Luego, con asa de platino se toma una colonia del medio sólido y se emulsiona con la solución fisiológica. Se extiende con el asa en forma de capa delgada y uniforme.

- Se procede a la fijación del extendido. Para ello se pasa lentamente el portaobjeto, en forma horizontal, sobre la llama del mechero manteniendo el extendido hacia arriba. La operación se repite hasta sequedad total, cuidando evitar la combustión del extendido.

Tinción

Tinción simple

- Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y se deja actuar unos minutos.

- Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de forma suave, con ayuda de piseta. Se seca el extendido de la forma descripta anteriormente.

- Se observa al microscopio.

Tinción diferencial. Método de Gram

Sobre el extendido realizado en el punto anterior se realiza el siguiente tratamiento.

PASO DEL PROCESO REACCION Y COLORACION DE LAS BACTERIAS

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Solución de Cristal

Violeta al 1%.

Se deja actuar 1 minuto

Células color violeta Células color violeta

Solución Yodo- Iodurada.

Se deja actuar 1 a 2

minutos

Formación del complejo

Yodo – Cristal Violeta

en el interior de las células

Las células permanecen

violetas

Formación del complejo

Yodo – Cristal Violeta

en el interior de las células

Las células permanecen

violetas

Solución de alcohol

Acetona.

Se deja actuar 20

Segundos

El complejo Yodo – Cristal

Violeta no sale de las

Células, las que conservan el color violeta.

El complejo Yodo – Cristal

Violeta se separa de las

Células, las que pierden el

Color y no pueden observarse

Solución de Safranina.

Se deja actuar 1 a 2

Minutos

Las células conservan el

Color Violeta.

Las células decoloradas se Tiñen de rojo

Lavar, secar y observar al microscopio

Observación al microscopio

Observación al microscopio

Fundamentos

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original.

Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos.

El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético. Los microscopios ópticos generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.

Las lentes de un microscopio óptico son el colector, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final.

Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.

La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento su objetivo y de su ocular. En general, los aumentos del objetivo son 10x,

40x y 100x (objetivo de inmersión) y los del ocular 5x, 10x y 15x. Por lo tanto, si se trabaja con un ocular de 10x y un objetivo de 100x, el aumento total será 10 x 100 = 1000 veces el tamaño original. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento.

Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es, la distancia mínima a la que se pueden ver dos objetos separados. Viene definido por una fórmula en la que las principales variables son la longitud de onda de la luz y la apertura numérica del objetivo, pero en la práctica, y asumiendo la máxima calidad de las lentes, es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz con la que se observa. En microscopía

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