DIVERSIDAD CELULAR I. CELULAS PROCARIOTAS: TINCION Y OBSERVACION.

DIVERSIDAD CELULAR I. CELULAS PROCARIOTAS: TINCION Y OBSERVACION.

CELL DIVERSITY I. PROKARYOTIC: STAINED AND OBSERVED.

Jiménez B, Córdoba K, Pineda A.  

RESUMEN

La célula es la unidad morfológica y funcional de todo ser vivo, es el elemento de menor tamaño que puede considerarse vivo. Cada célula es un sistema abierto que intercambia materia y energía con su medio. En una célula ocurren todas las funciones vitales, de manera que basta una sola de ellas para tener un ser vivo (que será un ser vivo unicelular). Este nombre fue dado por su descubridor Roberto Hooke, en 1665.

Existen dos tipos de células fundamentales: procariotas, las cuales carecen de un núcleo celular definido, es decir cuyo material genético se encuentra disperso en el citoplasma, distinguimos en esta  las bacterias;  y las eucariotas, que tienen un núcleo definido gracias a una membrana nuclear donde contiene su material hereditario, podemos distinguir dos tipos de células que presentan algunas diferencias: son células animales y vegetales. 

En esta experiencia nos centramos en las células procariotas, sus características, propiedades y su clasificación. Así también como observarlas siguiendo el procedimiento de la tinción y hacer las preparaciones adecuadas para lograrlo.

PALABRAS CLAVES

Célula procariota, bacteria, arqueobacterias, cianobacterias, membrana nuclear, tinción, polisacáridos, microorganismos unicelulares, fisiología, morfología.

ABSTRACT

The cell is the morphological and functional unit of all living things, is the smallest element that can be considered alive. Each cell is an open system that exchanges matter and energy with their environment. In a cell all vital functions, so that just one of them to have a living being (which is a single-celled living being) occur. This name was given by its discoverer Robert Hooke in 1665.

There are two fundamental types of cells: prokaryotes, which lack a defined nucleus, ie whose genetic material is dispersed in the cytoplasm, distinguish this bacteria; and eukaryotes, which have a nucleus by a nuclear membrane which contains its genetic material, can distinguish two types of cells presenting some differences are animal and plant cells.

In this experience we focus on prokaryotic cells, their characteristics, properties and ranking. As well as observe them following the staining procedure and make appropriate preparations to achieve.

INTRODUCCION

Las procariotas son células pequeñas y de estructura muy sencilla. Carecen de envoltura nuclear (carioteca), con lo cual el contenido del núcleo está diseminado en la zona central del citoplasma. Las procariotas constituyen microorganismos unicelulares de vida muy simple. La célula procariota es sin duda la más primitiva, conociéndose registros fósiles del Precámbrico, hace más de 3.000 millones de años. A pesar de su estructura muy sencilla,  han sobrevivido gracias a la plasticidad de su fisiología, que le permite ocupar ambientes donde no sobreviven las eucariotas. Están cubiertas externamente por una cápsula gelatinosa protectora, constituida por polisacáridos, debajo de esta capsula esta la pared celular compuesta por  lípidos, polisacáridos y proteínas que ofrece a la célula una protección mecánica que la hace resistente a diferencias de presión con respecto al medio externo; y permite también el intercambio de moléculas con este medio. Como ejemplos de este tipo de células están las arqueobacterias, las bacterias y las algas verde azuladas llamadas cianobacterias.

Las bacterias son importantes dado el papel que cumplen en el ámbito de la industria, la medicina y la agricultura. Las bacterias se pueden clasificar de acuerdo a su forma (morfología) o la coloración de GRAM.

La técnica llamada tinción de Gram, consiste en colorearlas para observar cómo reaccionan las paredes celulares al colorante, se preparan en soluciones acuosas y orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren una gran variedad de colores a los microorganismos.

Dentro de la clasificación morfológica las formas más características son:

• Bacilos: cuando tienen forma de bastón.
• Cocos: de forma redondeada.
• Espirilos: en forma de espiral.
• Vibrión: cuando tienen forma de coma.
• Estreptococo: cuando hay agregaciones se pueden denominar.
• Estafilococos: si se agrupan en forma de racimo. entre otras.

De acuerdo a la técnica de tinción de Gram se clasifican en:

• Gram positivas: Aquellas que se tiñen de color azul o violeta debido a que sus gruesas paredes de mureína retienen el colorante.
• Gram negativas: son las que no se tiñen y se caracterizan por tener una doble membrana lipídica con una fina pared celular entre ambas.  

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• MATERIALES

• Cultivo de microorganismos, Kumis o yogurt, Azul de metileno, Solución colorante de cristal violeta, Colorante de Gram, Violeta de genciana, Toallas de papel secante o servilletas, Microscopio, Aceite de inmersión, Asa de inoculación punta redonda, Portaobjetos, Cubreobjetos, Beaker, Pipeta, Mechero, Agua destilada, Goteros, Papel filtro, Etanol al 95%.

• PROCEDIMIENTO

1. PREPARACION DE UN FROTIS: Comprende tres etapas.

1. EXTENDIDO

• Disolver la muestra en una caja Petri con un poco de agua destilada; mezclarla con el asa.
• Preparar un portaobjetos limpio.
• Introducir el asa en un beaker con agua destilada (para limpiarla) y luego flamearlo hasta rojo vivo; introducirla de nuevo en el agua destilada (para enfriarla).

• Tomar una muestra con el asa (si es líquida) y colocarla sobre un portaobjetos limpio zigzagueando.

• Si la muestra proviene de un cultivo en medio sólido, colocar primero una gota de agua sobre el portaobjetos, tomar la muestra con el asa, tocar la gota, quemar el asa y luego enfriada, mezclar bien con el agua.

1. SECAR

• Puede acelerarse el secado, manteniendo la lámina encima de la llama del mechero a 15 cm o más de distancia. Es conveniente sostener el portaobjetos con la mano,  ya que si la mano no soporta el calor de la llama, las células pueden deformarse y teñirse defectuosamente.

1. FIJAR

• Con el frotis seco, pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fijar.

1. TECNICA PARA LA COLORACION DE BACTERIAS: cada una de las cuales comprende varios pasos.

1. COLORACION SIMPLE

• Preparar un frotis según la técnica habitual antes descrita.
• Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones.
• Cubrir la preparación con 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno y dejar 1 min (o cristal violeta y dejar 30s).
• Lavar con agua.
• Secar con papel filtro o encima del mechero.
• Observar al microscopio con lente de inmersión y determinar forma, disposición y relación de  tamaños de las distintas bacterias.

1. COLORACION DE GRAM (TECNICA DE HUCKER)

• Preparar un frotis según la técnica antes descrita.

• Colocar el portaobjetos sobre un soporte para tinciones.
• Cubrir con solución de cristal violeta y dejar actuar 1min.
• Lavar suavemente con agua de la pluma o grifo.
• Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min.
• Lavar de la misma manera.
• Cubrir con etanol 95% (decolorante de Gram) y dejar 30s moviendo suavemente la lámina. Seguir lavando hasta que éste no arrastre más colorante.
• Lavar con agua.
• Cubrir con solución de safranina o Fuscina de Gram y dejar 1 min.
• Lavar y secar.
• Observar con objetivo de inmersión y determinar forma, disposición y relación de  tamaños de las distintas bacterias.

1. RELACION ENTRE CELULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

• Tomar un palillo de dientes y realizar un frotis sobre el epitelio interno de la mejilla y colocarlo sobre un portaobjetos zigzagueando sobre él y teñir con azul de metileno.
• Salir del laboratorio y consumir un poco de yogurt.
• Esperar dos minutos y realizar un frotis de la mejilla interna.
• Esparcir la muestra sobre un portaobjetos; dejar secar  y teñir con azul de metileno.
• Secar y observar las células procariotas adosadas sobre las células del epitelio escamoso de la mejilla.
• Dibujar, explicar o describir sus observaciones.

• RESULTADOS

1. Luego de aprender la preparación de un frotis, seguimos paso a paso la técnica de coloración para bacterias, en coloración simple observamos una gran cantidad de bacterias, esparcidas y de forma redondeada, algunas más grandes que otras.
2. El mismo procedimiento en coloración de Gram, vimos grandes cantidades de bacterias, y logramos distinguir las Gram positivas y Gram negativas, guiándonos de la coloración de cada una.
3. Luego, al hacer el  montaje de la muestra de la mejilla, observamos las células epiteliales de forma circular y con pequeñas manchas en el centro.

• DISCUSIONES

1. En la coloración simple no se distingue que tipo de célula es, porque el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
2. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. Es por eso que las Gram positivas y Gram negativas toman esas coloraciones.
3. Este epitelio está constituido por células de un contorno irregular, prácticamente incoloras a la luz blanca, por lo que, para su observación es preciso realizar un proceso previo de tinción, en este caso con azul de metileno, que permitió observar un citoplasma granulado y un núcleo claramente diferenciado.

• ANEXOS

1. ¿Por qué deben utilizarse coloraciones para observar los microorganismos?

• Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo.

1. ¿Para qué se usa la coloración de azul de metileno?

• se usa para darle coloración a aquellos microorganismos que son traslucidos, pinta los núcleos de las células al mirarlas en un microscopio de esta manera podremos observar mejor las estructuras que conforman esa célula.  

1. ¿según Gram como se dividen las bacterias?

• La pared celular que rodea  a las bacterias es compleja y existen dos formas básicas: pared celular Gram positiva con una gruesa capa de péptidoglucano y una pared gramnegativa con una delgada capa de péptidoglucano, así como una membrana externa.

Para clasificar a las bacterias debemos tener en cuenta su tamaño,  forma, disposición espacial, propiedades.

• BACTERIAS GRAM POSITIVAS

• Poseen una pared celular interna y una pared de péptidoglucano.
• No tiene membrana externa
• No tiene espacio periplasmático
• La red de mureína está muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas
• La penicilina mata a las Gram positivas, ya que bloquea la formación de enlaces peptídicos entre las diferentes cadenas del péptidoglucano
• No contiene LPS
• En la tinción de Gram, retienen la tinción azul
• Conservan el complejo yodo colorante

• Son esporulantes y no esporulantes, como Estreptococos, Cisteria, Frankia.

• Poseen otros componentes: ácidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacáridos complejos.

• BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

• Poseen una pared celular más compleja:

• pared celular interna.
• pared de péptidoglucano.
• bicapa lipídica externa

• Membrana externa: forma un saco rígido alrededor de la bacteria, mantiene estructura y es barrera impermeable a macromoléculas, ofrece protección en condiciones adversas
• Espacio periplasmático: espacio entre la superficie externa de la membrana citoplasmática y la interna de la membrana externa.
• La red de mureína presenta una sola capa.
• La penicilina no mata a las Gram negativas, a causa de la capa de lipopolisacáridos  situada en la parte externa de la pared celular.
• Contiene LPS: estimulador de respuestas inmunes: activa células B, liberación de IL,  FNT, IL 6 por macrófagos.
• Quedan decoloradas.
• Pierden el complejo yodo colorante.
• Pueden ser anaerobios o aerobios.
• Poseen proteínas con concentraciones elevadas.

1. ¿Por qué se debe enfriar el asa antes de usarla?

• Después de esterilizarla se debe dejar enfriar antes de tomar la muestra, para evitar que el calor destruya a los microorganismos.

1. ¿Cómo se clasifican las bacterias según su forma?

• Según su forma se clasifican en:

• Cocos: de forma redondeada; tienen la capacidad de vivir como células individuales o bien de enlazarse hasta forman cadenas y racimos. Los  tipos de bacterias más comunes dentro de esta clasificación son Diplococo: Cocos en grupos de dos; Sarcinas: Cocos en grupos de cuatro; Estreptococo: cuando hay agregaciones; Estafilococos: si se agrupan en forma de racimo.
• Bacilos: cuando tienen forma de bastón; presenta formas variables: Vibrio: Ligeramente curvados y en forma de coma; Cocobacilo: estado intermedio entre coco y bacilo; Fusiformes: bacilos alargados y delgados, en forma de filamentos o cabellos.
• Espirilos: caracterizadas por su forma espiral o tipo sacacorchos.  Prefieren generalmente un medio acuático, donde el nivel de oxígeno es menor que en la atmósfera. Tienen una pared celular rígida y usan flagelos (un apéndice largo, parecido a un látigo) en cada extremo para moverse.

1. ¿porque se dice que la coloración con  azul de metileno es una coloración simple y directa y con GRAM es una coloración diferencial?

• Tinción simple: se llama así porque nada más usan un (1) solo colorante, que puede ser azul de metileno, cristal violeta o carbol fucsina. Con este tipo de tinción tú vas a poder crear un contraste con el medio donde estás haciendo el frotis o tinción y vas a poder observar la morfología y la disposición bacteriana.
• Tinción diferencial: es aquella donde usas más de un (1) colorante. Con esta tinción tú vas a poder ver morfología, tamaño, organización de las bacterias y además categorizar los microorganismos en varios grupos, según su afinidad con el colorante que tu estas utilizando.

1. ¿Cuál es la diferencia entre capsula y capa mucosa en la bacteria?

• La cápsula es una capa rígida que queda fuertemente adherida a la pared celular. Se observa por tinción negativa (tinta china). Las bacterias que la tienen producen colonias de aspecto mucoso.  Mientras que la capa mucosa es una capa laxa no tan adherida como la cápsula, por tanto no se puede observar por tinción negativa, sólo se aprecia a microscopio electrónico y en el hábitat natural (no en el laboratorio).

1. ¿Cuál es la composición química de la capsula bacteriana?

• En general, el material capsular se compone de macromoléculas asimétricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas: polisacáridos o polipéptidos.

1. cápsulas polisacarídicas:

• Heteropolisacáridos aniónicos, cuyas unidades repetitivas constan de azúcares (osas), aminoazúcares, ácidos urónicos, polioles (en muchos casos con radicales fosfato, formiato, succinato, etc.).
• Homopolisacáridos neutros, como dextranos, celulosa, alginatos.

1. cápsulas polipeptídicas: están formadas por glutamil-polipéptidos. Las cápsulas y capas mucilaginosas bacterianas constituyen el llamado antígeno K (capsular).

1. ¿Qué tipo de antibiótico se conocen para bacterias GRAM positivas y GRAM negativas?

• Antibióticos para bacterias Gram positivas:

• Las penicilinas.
• Amoxicilina y cefalosporinas.
• La eritromicina y fármacos similares (claritromicina, azitromicina, etc.
• Glicopeptidos: vancomicina, teicoplanina.lincomicina y clindamicina.
• Las penicilinas g.

• Antibióticos para bacterias Gram negativas:

• Los aminoglucósidos.
• Aminopenicilinas (amoxicilina, ampicilina, etc.).
• Gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina.
• Quinolomas: hay 2 subgrupos de quinolonas. las más antiguas (ácido nalidíxico, ácido pipemídico ).
• La ampicilina y la amoxicilina tienen un rango de acción similar a la penicilina-g.las penicilinas antipseudomonas, pseudomonas.
• Aminoglucósidos: la estreptomicina. tetraciclinas.

• CONCLUSIÓN

En este proceso, aprendimos la clasificación de las células, nos centramos en las células procariotas, conociendo sus estructuras, propiedades y características, Así también, aprendimos técnicas para lograr observarlas en el microscopio, siguiendo las indicaciones del docente, logramos obtener buenos resultados haciendo buen uso del microscopio y aplicando las técnicas correctas.

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