TOMA DE MUESTRAS CLÍNICAS EXAMEN FINAL

JERSSON EDUARDO MARTINEZ LONDOÑO

CODIGO: 14112107

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA

TOMA DE MUESTRAS CLÍNICAS

EXAMEN FINAL

En forma individual o en grupos realicen una revisión de literatura que deben traer en físico el lunes 1 de Junio, entre las 7 am y las 10 am, a la oficina 3 del programa de medicina veterinaria, que responda las siguientes preguntas:

1. Indique Cuales serían las mejores muestras para el diagnóstico microbiológico de:

 Leptospira spp en bovinos

 Brucella spp en caninos

 Mycobacterium spp en Aves de zoológico

 Virus Influenza en porcinos.

2. De cada una de las muestras mencionadas anteriormente, explique como la obtendría y como la transportaría al laboratorio.

Solución

1. Mejores muestras

• Leptospira spp en bovinos

La demostración de la presencia de leptospiras o sus componentes en la sangre, tejidos y/o leche de animales con signos clínicos, tiene un gran valor diagnóstico (Ellis, 1996). En el caso de animales muertos o sacrificados, las muestras que se deben enviar son cerebro, médula espinal, líquido cefalorraquídeo y ojo en casos con sintomatología nerviosa, y la mayoría de los órganos parenquimatosos en los casos que cursan con ictericia (Ellis, 1986). En animales vivos, se enviará sangre y leche en la fase aguda de la enfermedad y orina en la fase crónica. En los fetos, los órganos de elección son el hígado, riñón, cerebro, glándula adrenal y pulmón, así como cualquier fluido interno (Ellis, 1996).

• Brucella spp en caninos

El hemocultivo sigue siendo el método recomendado antes de declarar al animal infectado, pero como la bacteriemia puede ser intermitente un cultivo negativo no puede usarse como criterio para excluir una infección por Brucella canis (Flores-Castro et al., 1977; Shin y Carmichael, 1999; Lucero et al., 2002; Ebani et al., 2003; Miranda y Báez, 2005).

El aislamiento de Brucella spp. Constituye el método diagnóstico definitivo. Suele obtenerse por hemocultivo o cultivo de médula ósea y, más raramente, por cultivo de líquido cefalorraquídeo, líquido articular, exudado purulento, etc. El medio clásico de Ruiz Castañeda, que utiliza una fase sólida y otra líquida, es el más apropiado para el diagnóstico. En la mayoría de los procesos agudos, tras incubar el medio 2-4 días, es posible observar en la fase sólida pequeñas colonias que se deslizan por el agar en forma que recuerdan las lágrimas de cera resbalando por la vela. Una pequeña proporción de casos presenta el crecimiento entre los 5-15 días, y sólo de forma excepcional, éste se retrasa hasta pasados 30-45 días. Consiste en la inoculación de sangre en frascos herméticamente cerrados que contienen, simultáneamente, un medio líquido (caldo triptosa) y un medio sólido (agar triptosa). Los cultivos deben mantenerse en incubación un tiempo no menor a 30 días debido a que las bacterias del género Brucella son de crecimiento lento. En los últimos años se han desarrollado sistemas de hemocultivo automáticos o semiautomáticos entre los que se destaca el Bactec, que permite detectar más del 95% de los cultivos positivos antes del séptimo día de incubación. (Ruiz Castañeda m. 1961)

• Mycobacterium spp en Aves de zoológico

Tomar muestras de tejido esplénico, hepático, entérico, sanguíneo y pulmonar, los cuales se procesan, siembran en medio de cultivo y se someten a extracción de ADN, con el cual se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa. (Rodríguez G. et al., 2011)

• Virus Influenza en porcinos.

Bronco alveolar o suero. La muestra debe tomarse en las primeras 72 horas de iniciado el padecimiento y mantenerse a 4°C. El diagnóstico puede requerir también el aislamiento del virus por cultivo en líneas celulares o en embrión de pollo. Las técnicas utilizadas para la identificación son la inmunofluorescencia indirecta o directa y la inhibición de la hemaglutinación. La demostración de la presencia de ácidos nucleicos virales por la técnica de RT-PCR es un método muy rápido y sensible para el diagnóstico. (Martínez I. 2014)

2. Obtención y transporte

* Mycobacterium spp en aves de zoológico

• HEMATOLOGIA

Los síntomas, como expresión de una anomalía funcional en un animal enfermo, son de difícil percepción en fauna silvestre. Sin embargo el análisis de sangre por cuadro hemático constituye una manifestación fidedigna sintomática de un proceso morboso en el organismo. Por lo tanto el cuadro hemático se convierte en una herramienta de enorme valor práctico por su fácil acceso en todos los casos donde se sospeche de una enfermedad. Debe tenerse en cuenta que el porcentaje de los casos en que el examen de la sangre consigue establecer directamente el diagnóstico es muy bajo (excepto las hemoparasitosis) y que su importancia solo se detecta cuando se diagnostica como síntoma (Fowler, 1986).

En AVES se ha dividido según la longitud del hueso metatarsiano que expone la vena metatarsal medial, como proceden Hill y Burdick (1996). En aves con metatarso largo como Falconiformes y Paseriformes la primera elección es la vena metatarsal  y la segunda la vena braquial; en aves con metatarso corto como los Psitácidos la primera elección es la vena braquial. En aves muy pequeñas de menos de 80 gramos la primera elección es la vena yugular y como segunda elección la vena braquial (Hill y Burdick, 1996).

• CITOLOGÍA:

Muchas muestras biológicas obtenidas por biopsia o necropsia e inclusive las secreciones obtenidas post -punción nos pueden dan pistas por su naturaleza celular y sobre que evento fisiológico o patológico está sucediendo. Para ello la Tinción rápida de H & E debido a sus capacidades tinto riales por gradientes de pH permite establecer con certeza la naturaleza de la muestra biológica (GAVIÑO et al, 1975). En este caso se procede así: Tinción de Hematoxilina y Eosina: 1) Tinción general de Hematoxilina & Eosina 2) Poner la muestra sobre la lámina y si es necesario hacer squash Adicionar Hematoxilina 12- 15 min. 3) Lavar con Agua 4) Adicionar Solución Acida 15 seg. Máximo 5) Lavar con agua Agregar Solución Básica hasta que el frotis muestre un color azul. Aproximadamente, 15 seg. 8) Lavar con agua Adicionar Eosina máximo 20 seg. 9) Lavar con agua 10) Observar: Las estructuras acidófilas (Núcleos Celulares) se tiñen de color azul; las estructuras Basófilos (Citoplasmas, Fibras y Formes ) se tiñen de color rosado (GAVIÑO et al, 1975).

• Tinción Ziehl Nielsen:

 Para mycobacterium acido resistentes, requiere de:

• La solución de fucsina fenicada se prepara mezclando 1 gr. de fucsina básica con 10 ml de alcohol etílico al 95 % a los que se les adicionan 90 ml. de fenol o ácido fénico al 5 %.
• Solución alcohol ácido: Se prepara mezclando 2 ml. de HCL de alta graduación con 98 ml de alcohol etílico al 95 %
• Solución de azul de metileno al 5 %. Se mezclan 10 g. de azul de metileno en 100 ml. de agua destilada. Rutina de Coloración: Al frotis habitual se le adiciona la fucsina fenicada en exceso y luego se calienta hasta producción de vapores por espacio de 3 min. Se decolora con solución alcohol ácido y finalmente se colorea de nuevo con solución de azul de metileno. Lavar y observar. Acido resistentes positivos tiñen rojo y ácido resistente negativo azul (DAVIES et al, 1984; KONEMAN et al, 1987).

• Influenza porcina

El requisito principal a la hora de valorar las muestras del tracto respiratorio es que éstas deben contener el mayor número posible de células epiteliales, que son en las que fundamentalmente se replica el virus. En este sentido, resultan apropiadas para la investigación de virus gripales las muestras respiratorias tales como los frotis de faringe o nasofaringe y los lavados o aspirados nasales o bronquiales, obtenidos durante los primeros días de la enfermedad.

Fluidos orales - toma de muestras

Durante estos últimos años, se han desarrollado y validado nuevas herramientas de muestreo, monitoreo, y diagnóstico en porcino que resulten más rápidas, sencillas y menos costosas.
Una de estas técnicas es la toma y el uso de fluidos orales (saliva) como espécimen para diagnóstico en porcino. Esta técnica ya ha sido validada experimentalmente para PRRSV, PCV2 e influenza, y se está utilizando de forma rutinaria en los sistemas productivos de EEUU para la detección de PRRSV e influenza a nivel de población. Brevemente, la técnica se basa en suspender una cuerda de algodón en un corral para que los cerdos la muerdan mientras depositan su saliva en ella (Prickett et al. 2008)

1. Toma de muestras:

Materiales necesarios: Cuerda de algodón 100% (no tratada con productos químicos), tijeras, bolsas de plástico (tipo Zipplog ®) y tubos de plástico estériles con base cónica o redondeada y con capacidad suficiente para el volumen de la muestra (5cc, 10cc, o 20cc).

Puntos clave:

• El número de cuerdas necesario para que el muestreo sea representativo dependerá del tamaño de la población, de la distribución de las naves, y del tamaño de los corrales (se considera que en naves de una sola planta de 1000 animales, 6 cuerdas son suficientes para detectar el 10% de prevalencia con un 95% de confianza (Detmer et al., 2010).
• El diámetro de la cuerda y la altura a que debe situarse dependerá de la edad de los animales, pero debe ser de fácil acceso para todo el grupo.

2. Recogida de la muestra:

Se corta la parte húmeda de la cuerda y se deposita en la bolsa de plástico limpia. Se procede a extraer la saliva 

3. Conservación:

• La suciedad de las muestras (artefactos) puede interferir en el resultado del diagnóstico. Por ello la saliva tiene que ser centrifugada (1000-2000 rpm/30 min.) o al menos, permitir durante 60 min. que las partículas de suciedad presentes en la muestra se depositen en el fondo del tubo. Con el sobrenadante, proceder a su análisis o conservación.
• Las muestras deben ser mantenidas en refrigeración (4-10°C). A 4°C se pueden tener hasta 12 días sin que por ello se vea alterada la detección de PRRSV mediante PCR. Para su conservación las muestras deben ser congeladas (-20°C o -80°C).

4. Análisis:

La detección de patógenos virales y bacterianos se realiza mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El RNA viral de PRRS e influenza pueden ser detectados en saliva a las 24 h. PI. La detección de anticuerpos frente a PRRSV y PCV2 se puede realizar mediante el test de ELISA y supone una alternativa al PCR para disminuir costes de diagnóstico. Sin embargo, el aislamiento vírico de PRRSV y PCV2 aún no se realiza y en el caso de influenza, el porcentaje de aislamiento a partir de fluidos orales PCR positivos es del 51%.

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